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大咖講堂 | 相干拉曼散射顯微術(shù) Ⅱ

更新時(shí)間:2019-11-29      點(diǎn)擊次數(shù):2054

 

上節(jié)我們講到——相干拉曼散射(CRS)顯微術(shù)是一種基于分子化學(xué)鍵振動(dòng)的成像手段。相比于熒光光譜,拉曼光譜具有窄得多的譜峰寬度(圖 1),可以選擇探測(cè)的分子種類將更多,特異性也更高。例如,生物組織中的蛋白、脂質(zhì)和核酸等具有各自的拉曼光譜特征,利用 CRS 可以在無需染色/標(biāo)記的前提下對(duì)它們進(jìn)行區(qū)分成像。

 

但脫離應(yīng)用的理論就像浩渺星海中失去坐標(biāo)的飛船,空得一身高強(qiáng)本領(lǐng)卻無處發(fā)揮。因此,秉承上節(jié)所述的相干拉曼顯微術(shù)的基本原理,本小節(jié)將圍繞快速病理檢測(cè)、生物代謝和藥物運(yùn)輸三個(gè)典型方面詳細(xì)展開免標(biāo)記相干拉曼顯微術(shù)的應(yīng)用,為這艘“神州飛船”的前行指引明燈。

圖 1. 常見生物組分和分子的拉曼光譜

 

 

快速病理檢測(cè):

病理檢測(cè)是疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)有的病理檢測(cè)方法需要經(jīng)過活檢(或手術(shù))取樣、固定、切片、染色等一系列繁雜過程,往往耗時(shí)幾天,無法實(shí)現(xiàn)術(shù)中實(shí)時(shí)診斷。術(shù)中冰凍往往也至少需要半個(gè)小時(shí),而且診斷準(zhǔn)確率不高。基于生物組織內(nèi)源性光學(xué)信號(hào)的成像方法有望快速提供組織病理學(xué)信息,輔助術(shù)中診斷。

2013 年,季敏標(biāo)教授在哈佛大學(xué)謝曉亮教授課題組學(xué)習(xí)期間利用 SRS 顯微鏡實(shí)現(xiàn)了在腦膠質(zhì)瘤小鼠模型活體中原位實(shí)時(shí)地探測(cè)腫瘤邊界[1],之后在離體人腦腫瘤手術(shù)標(biāo)本中實(shí)現(xiàn)無標(biāo)記病理診斷[2]。歸國(guó)后,季教授課題組在復(fù)旦大學(xué)搭建了結(jié)合了 SRS、SHG 和 TPEF 的多模態(tài)非線性光學(xué)成像系統(tǒng),可同時(shí)獲取脂質(zhì)、蛋白、膠原纖維三個(gè)通道的圖像。在近期一篇文章中,季教授不僅在喉癌組織切片層面展示了 SRS 和傳統(tǒng)病理 HE 染色的高度一致性(圖 2),并且通過對(duì)喉癌術(shù)中新鮮組織的成像,累計(jì)了數(shù)萬份圖像數(shù)據(jù),后基于搭建的 34 層殘差卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ResNet34)進(jìn)行圖像訓(xùn)練識(shí)別,獲得了近乎 100%準(zhǔn)確率的腫瘤與正常組織的鑒別效果[3] 

 

由于 SRS 繼承了自發(fā)拉曼的光譜特性,使其能夠在高光譜掃描時(shí)得到重要的譜學(xué)信息。在對(duì)阿爾茲海默(AD)研究的過程中[4] ,發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤折疊的淀粉樣蛋白會(huì)因?yàn)?β-sheet 的富集而導(dǎo)致 amide I 的拉曼峰藍(lán)移(峰位從 1658 cm-1變?yōu)?1670 cm-1);并且通過對(duì)新鮮 AD 鼠腦組織成像,觀察到了每個(gè) Aβ 斑塊的周圍都會(huì)有一圈“Halo”的特殊構(gòu)象(圖 3),這是熒光研究(只能對(duì)確定物質(zhì)進(jìn)行特異性染色)所難以發(fā)現(xiàn)的,充分體現(xiàn)了 SRS 在病理學(xué)檢測(cè)上的*優(yōu)勢(shì)。

▲圖 2. SRS 與 HE 圖像的一致性對(duì)比(綠:脂質(zhì);藍(lán):蛋白質(zhì);紅:膠原纖維)[3]

 

▲圖 3. 新鮮 AD 鼠腦的 SRS 光譜圖像以及斑塊、正常組織的光譜差異 [4]。(a-c)指紋區(qū)的光譜圖像,綠:脂質(zhì);藍(lán):正常蛋白質(zhì);洋紅:淀粉樣蛋白斑塊。(d-f)C-H 伸縮振動(dòng)區(qū)的光譜圖像,綠:脂質(zhì);洋紅:總蛋白質(zhì)。(g-h)不同組織區(qū)域的 SRS 光譜

 

 

生物代謝:

以高時(shí)空分辨率直接觀察活體動(dòng)物的代謝動(dòng)力學(xué)對(duì)理解許多生物學(xué)過程至關(guān)重要。脂類分子是重要的生命組成物質(zhì),但定量地觀察其空間分布一直是一個(gè)難題。使用熒光基團(tuán)時(shí),有可能產(chǎn)生假象,做出的判斷有偏差。相比之下,SRS 可以對(duì)分子直接可視化,得到的結(jié)果具有普遍意義。

2018 年,哥倫比亞大學(xué)閔瑋教授課題組發(fā)展了將重水(D2O)代謝與受激拉曼散射(DO-SRS)顯微技術(shù)相結(jié)合的技術(shù),用于原位代謝觀測(cè)[5] 。在生物代謝過程中,經(jīng)過酶的催化合成,D2O 中的氘原子會(huì)被自動(dòng)整合到有機(jī)分子中,形成同位素標(biāo)記的 C-D 鍵。因此,基于對(duì)新合成有機(jī)分子中 C-D 鍵的成像,就可以實(shí)現(xiàn)生物代謝的追蹤觀測(cè)(視頻 1)。目前,在 C-D 鍵的廣泛振動(dòng)光譜中,他們發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的特異性拉曼位移,并開發(fā)了光譜解調(diào)方法來獲得具有大分子選擇性的 C-D 信號(hào),做到了在動(dòng)物模型中脂質(zhì)、蛋白甚至糖類的代謝測(cè)量[6][7]。 

 

▲視頻 1.秀麗隱桿線蟲的脂質(zhì) SRS 實(shí)時(shí)成像(左:原本存在的脂質(zhì);右:利用 D2O 新合成氘代脂質(zhì))[5]

 

 

藥物運(yùn)輸:

在醫(yī)藥學(xué)中,藥物的運(yùn)輸是學(xué)者們關(guān)注的重點(diǎn)之一,準(zhǔn)確地運(yùn)輸過程及定位,是藥物分子能實(shí)現(xiàn)特定生理功能的重要保障。制作小分子藥物的熒光標(biāo)簽并非容易之事,常用的熒光標(biāo)簽往往比藥物分子大很多,這會(huì)影響他們的運(yùn)輸特性;因此,利用傳統(tǒng)熒光標(biāo)記方法追蹤小分子藥物面臨很多挑戰(zhàn)。而很多藥物分子本身具有特殊的化學(xué)鍵振動(dòng)(圖 4),因此,利用 SRS 可以對(duì)該藥物進(jìn)行很好的特異性成像,加之 SRS 不需要對(duì)樣品固定、染色等操作,保持了生物體樣品的活性,可以實(shí)現(xiàn)系列活體動(dòng)態(tài)捕捉。

2014 年,閔瑋教授將療霉舒乳膏涂抹于小鼠耳朵部位,通過對(duì)藥膏中鹽酸特比萘芬分子的炔基進(jìn)行特異性成像,結(jié)合脂質(zhì)和蛋白通道的共定位,發(fā)現(xiàn)了該藥物是通過皮膚中脂質(zhì)進(jìn)行滲透的[8](圖 5)。

 

同年,謝曉亮教授課題組報(bào)道了利用高光譜受激拉曼散射(hsSRS)成像技術(shù)對(duì)兩種酪氨酸激酶抑制劑(TKI)藥物(伊馬替尼和尼洛替尼)在活細(xì)胞內(nèi)的免標(biāo)記成像以及定量分析[9] 。他們發(fā)現(xiàn),由于這兩種藥物具有溶酶體的親溶性,它們?cè)谌苊阁w中的濃度都增加了 1000 倍以上。當(dāng)同時(shí)使用氯喹時(shí),伊馬替尼的溶酶體捕獲減少了十倍以上,這表明氯喹除了常見的自噬抑制機(jī)制外,還可能通過溶酶體介導(dǎo)的藥物相互作用提高 TKIs 的療效。

▲圖 4. 藥物分子的結(jié)構(gòu)式及其拉曼光譜 [9]

 

▲圖 5.局部應(yīng)用鹽酸特比萘芬對(duì)小鼠耳部皮膚的 SRS 成像(2230cm-1鹽酸特比萘芬;1655cm-1蛋白質(zhì);脂質(zhì) 2845cm-1脂質(zhì))[8]

 

 

下一節(jié)我們還將聚焦 CRS 發(fā)展前沿,介紹 CRS 技術(shù)的新進(jìn)展。

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