隨著光學(xué)技術(shù)的日益普及，越來越多的研究者將其應(yīng)用到了與人類健康密切相關(guān)的領(lǐng)域，但傳統(tǒng)的共聚焦成像已經(jīng)不能滿足需求，科學(xué)家們希望在更精細(xì)的維度深入探索人類疾病的發(fā)展進(jìn)程，了解病原體和宿主的相互作用，以及追蹤長時間的生物學(xué)過程。

LIGHTNING 顯著提升共聚焦分辨率和信噪比？

我們有圖，

你有真像！

今天給大家分享的是非常適合上述應(yīng)用的基于徠卡 SP8 共聚焦顯微鏡平臺的LIGHTNING 超高分辨率的一些成像實例。關(guān)注我們公眾號的各位想必從之前的推送中已經(jīng)了解 LIGHTNING 的原理和特點了，它結(jié)合高靈敏度的檢測器、創(chuàng)新的電子元件以及智能化的圖像信息提取技術(shù)，能為研究者提供超越共聚焦分辨率、突破光學(xué)衍射極限的超高分辨率圖像。

圖 1 為 4 色標(biāo)記的 Cos-7 細(xì)胞在普通共聚焦顯微鏡下（左）和 SP8 LIGHTNING 下（右）的成像結(jié)果。在 LIGHTING 圖像中，我們可以清晰辨別細(xì)胞核（藍(lán)色）、線粒體（綠色）、微絲（灰色）和微管（紅色）的邊緣形態(tài)，即使縱橫交錯的細(xì)胞骨架仍能被清楚識別。因此，整體圖像具有更好的對比度，為后期圖像分析的準(zhǔn)確度奠定了基礎(chǔ)。

▲圖 1. Cos-7 cells. Cyan: Nucleus, DAPI. Green: Mitochondria, TOM20 Oregon green. Red: Tubulin, TMR. Gray: Actin, SiR. Courtesy of Urs Ziegler, Jana Döhner, Center for Microscopy and Image Analysis (UZH), University of Zürich, Switzerland

美國 Hopkins 醫(yī)學(xué)院的 Holland 實驗室致力于研究控制精確染色體分布的分子機制以及線粒體錯誤在人類健康和疾病中的作用，視頻 1 和圖 2 是該實驗室連續(xù) 12 小時拍攝的分裂中的 RPE 細(xì)胞，青色為 eGFP-微管蛋白，紫色為 mRFP-組蛋白，可以發(fā)現(xiàn)，即使長時間成像，熒光信號仍然強烈。因此，SP8 LIGHTNING 特別適合超高分辨率的活細(xì)胞觀察。

▲視頻 1.RPE 細(xì)胞分裂時間序列成像

▲圖 2.12 h confocal time-lapse video of dividing RPE cells stably expressing eGFP-tubulin (cyan) and mRFP-Histidine H2B (magenta). Courtesy of C. Gliech, Holland Labs, John Hopkins School of Medicine, US

西班牙 Carlos III 國家心血管研究中心（CNIC）是世界有名的心血管研究機構(gòu)，專注于心血管方向的基礎(chǔ)研究及應(yīng)用轉(zhuǎn)化，如心血管藥物的開發(fā)。

圖 3 為該研究中心科學(xué)家拍攝的小鼠胚胎心臟超高分辨率圖像，藍(lán)色為血管，紅色為淋巴管壁膜，淋巴管細(xì)胞核為綠色。通過對大器官級別的大尺度、多色、超高分辨率成像，科學(xué)家能夠輕松觀察并研究心臟淋巴系統(tǒng)的發(fā)育情況。可見 LIGHTING 能夠輕松勝任器官、組織水平的多色和大范圍超高分辨率的前沿要求。

▲圖 3.Dorsal view of a mouse embryonic heart. Blue: Blood vessels, SMAcy3. Red: Membrane lymphatic vessel wall, Lyve1 633. Green: Nuclear lymphatic vessel, Prox1 cy5.5. Scale bar is 500 µm. Courtesy of Ghislaine Lioux etc., Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) Madrid, Spain

圖 4 是小鼠小腸切片，左右分別為共聚焦和 LIGHTNING 圖像。從 LIGHTNING 圖像上能看到更為清晰的杯狀細(xì)胞分泌的 WGA 粘液（黑白）、細(xì)胞核（綠色）以及刷狀緣（紅色）。可見 LIGHTNING 不僅提升了分辨率和信噪比，還保留了所有熒光分子的信息。

▲圖 4.FluoCells mouse intestine section. B&W Alexa Fluor 350 WGA mucus of goblet cells, Green SYTOX Green Nuclei, Red Alexa Fluor 568 phalloidin filamentous actin (brush border)

圖 5 為草履蟲基體的 LIGHTNING 圖像。采用高速成像，掃描分辨率 2495 x 2495。可見即使在高速掃描的條件下，LIGHTNING 仍然具有*的分辨率和清晰度，*勝任活體樣品的超快超高分辨率成像。

▲圖 5.Paramecium tetraurelia. Basal Body AF 488 (black & white). Imaging using resonant scanner at maximum FOV and format (2495 x 2495). 8 x line averaging. Image width: 100 µm. Sample Courtesy of Anne Aubusson-Fleury. Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), French National Centre for Scientific Research (CNRS), Gif-sur-Yvette, France

圖 6 是小鼠膈肌，左右分別為共聚焦和 LIGHTNING 的 3D 圖像。從右圖可以清晰地看到交感神經(jīng)以及突觸后分布的乙酰膽堿受體的精細(xì)結(jié)構(gòu)。

▲圖 6.Whole mount mouse diaphragm muscle was stained for nicotinic acetylcholine receptors, a principal postsynaptic component of neuromuscular junctions (red) and tyrosine hydroxylase, a marker for sympathetic neurones (green). Courtesy of Tatjana Straka and Rüdiger Rudolf, University of Applied Science, Germany

從上面的結(jié)果可以看出，SP8 LIGHTNING 在進(jìn)行超高分辨率成像的同時，還具有很強的提取圖像信息的能力，無論對于弱熒光信號的樣品、高速運動中的樣品、需 3D 成像的厚樣品，都能輕松獲取可用于定量分析的超高清圖像，還可以結(jié)合 Navigator 導(dǎo)航式智能拼圖，進(jìn)行大樣品的超高成像。另外，LIGHTNING 超高分辨率成像技術(shù)還可應(yīng)用于 SP8 DIVE 光譜式多光子、STED 納米顯微鏡，進(jìn)一步提高其成像質(zhì)量！

更多的應(yīng)用實例，敬請期待。