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熒光壽命成像助力攻克癌癥熱點(diǎn)靶標(biāo)——四鏈DNA結(jié)構(gòu)

更新時間:2021-07-06      點(diǎn)擊次數(shù):1230

1953年,科學(xué)家詹姆斯-沃森和弗朗西斯-克里克發(fā)現(xiàn)了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu),遺傳學(xué)的研究進(jìn)入到分子層次,人們可以更深層的了解遺傳信息的構(gòu)成和傳遞途徑(圖1A)。近年,科學(xué)家在人類癌癥細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種四重螺旋體DNA分子——G-四鏈體(G-quadruplex)。它是由富含串聯(lián)重復(fù)鳥嘌呤(G)的DNA或RNA折疊形成的高級結(jié)構(gòu)。G-四分體(G-quartet)是四鏈體的結(jié)構(gòu)單元,由Hoogsteen氫鍵連接4個G形成環(huán)狀平面,兩層或以上的四分體通過π-π堆積形成四鏈體(圖1B)。
 
有研究表明,G-四鏈體更多的出現(xiàn)在癌細(xì)胞等快速分裂的細(xì)胞中,與癌基因的啟動子區(qū)域和DNA鏈的端粒區(qū)域相互作用。因此,G-四鏈體結(jié)構(gòu)與DNA復(fù)制過程有著緊密聯(lián)系,對于細(xì)胞分裂和增殖非常關(guān)鍵[1]。那么,通過靶向調(diào)控G-四鏈體結(jié)構(gòu)將有望成為選擇性抑制癌細(xì)胞增殖的新途徑,G-四鏈體也成為了癌癥治療藥物的重要靶標(biāo)。

圖1.A:James Dewey Waston(左)& Francis Harry Compton Crick(右)

B:G4-DNA的3D結(jié)構(gòu)
鑒于G4-DNA參與到很多生物過程當(dāng)中,開發(fā)用于檢測和可視化細(xì)胞中 G4-DNA 結(jié)構(gòu)的工具也尤為重要。倫敦帝國理工學(xué)院的研究人員開發(fā)了一種能夠在活細(xì)胞中檢測G4-DNA的熒光探針——DAOTA-M2,為人們揭開了這種結(jié)構(gòu)的神秘面紗 [2]
 
這種探針具備良好的活細(xì)胞滲透性和低細(xì)胞毒性,在與G4-DNA結(jié)合時會發(fā)出熒光,可以用來觀察G4-DNA是如何與活細(xì)胞內(nèi)的其他分子相互作用的。并且當(dāng)DAOTA-M2與不同的核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)結(jié)合時,將顯示出不同的熒光壽命信息,進(jìn)而可以非常精準(zhǔn)的區(qū)別雙螺旋DNA和G4 DNA(圖2),因?yàn)榕c四鏈體結(jié)合時熒光壽命更長(圖3)。

圖2. 熒光壽命置換測定的示意圖:競爭對手結(jié)合后,DAOTA-M2 從 G4-DNA 轉(zhuǎn)移到 dsDNA環(huán)境,導(dǎo)致其熒光壽命縮短


圖3 DAOTA-M2染色的活細(xì)胞U2OS細(xì)胞核DNA的FLIM分析(a)以 512 × 512 分辨率(λex=477 nm,λem=550–700 nm)記錄的熒光強(qiáng)度圖像,紅線表示用于 FLIM 分析的核分割(b) 來自 a 的 FLIM 圖,顯示在平均壽命 (τw) 9ns(紅色)和 13ns(藍(lán)色)之間(c) 平均核強(qiáng)度與平均核壽命(藍(lán)點(diǎn))的二維相關(guān)性(d)單個原子核的放大 FLIM 圖 - 顏色代表壽命,由 9ns(紅色)和 13ns(藍(lán)色)之間的顏色梯度條定義

G4-DNA的生物功能是通過動態(tài)的折疊和打開實(shí)現(xiàn)。在細(xì)胞內(nèi),G4-DNA可以自發(fā)折疊,但其打開是由專門的解旋酶來完成。并且在接下來的研究中,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)哺乳類動物中的DNA 解旋酶 FancJ 和 RTEL1的表達(dá)量減少將會導(dǎo)致DAOTA-M2熒光壽命變長(圖4)[3]。因此可以直接利用DAOTA-M2熒光壽命的變化監(jiān)測G4-DNA在活細(xì)胞中的動態(tài)變化。

圖4,減少 FancJ或RTEL1 解旋酶表達(dá)如何導(dǎo)致更長的 DAOTA-M2 壽命 (τw)的示意圖
G4-DNA被認(rèn)為是潛在癌癥治療藥物靶點(diǎn),因此評估給定的 G4-DNA靶向藥物與該結(jié)構(gòu)結(jié)合的能力將非常有用。通過不同處理后DAOTA-M2的熒光壽命變化,結(jié)果顯示雙羧酸功能化的Ni(Ni-salphen)與G4-DNA有很強(qiáng)的靶向結(jié)合能力,會在短時間內(nèi)導(dǎo)致DAOTA-M2熒光壽命迅速下降。(圖5)

圖5. 加入結(jié)合劑1-7hr的DAOTA-M2 的代表性 FLIM 成像結(jié)果(顯示在 6ns(紅色)和 14ns(藍(lán)色)之間)共孵育后 使用 DMSO(對照)、Zn-salphen、Nisalphen 。比例尺:20 μm

在以上的科研工作中,不難發(fā)現(xiàn),精準(zhǔn)的檢測方法是必須的,比如貫穿于整篇文獻(xiàn)中的FLIM技術(shù)。FLIM(Fluorescence Lifetime Imaging,熒光壽命成像):是一種基于熒光壽命的顯微成像技術(shù),其成像結(jié)果提供像素位點(diǎn)的壽命信息,使得我們在熒光強(qiáng)度成像之外,能更加深入地對樣品進(jìn)行功能性測量。熒光壽命成像具有不同于熒光強(qiáng)度成像的眾多優(yōu)點(diǎn),如不受熒光物質(zhì)濃度、光漂白、激發(fā)光強(qiáng)度等因素的影響。會因?yàn)榉肿訕?gòu)象、分子間相互作用、分子微環(huán)境、生理狀態(tài)等條件改變而發(fā)生變化。Leica全新STELLARIS 8 FALCON熒光壽命成像系統(tǒng),搭載新一代白激光(440-790nm)以及HyD X高靈敏度專用檢測器,提供超快速、多維度熒光壽命成像解決方案。
 
特異性探針與FLIM相結(jié)合使用,不僅可以用來監(jiān)測活細(xì)胞細(xì)胞核中G4-DNA的形成,以及判定小分子藥物與G4-DNA的相互作用,還可以應(yīng)用于G4-DNA靶向藥物的篩選。這些信息將為癌癥的診斷和治療帶來了新啟示,更有助于靶向性新療法新藥物的開發(fā)。

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