分色方法
多通道熒光成像的目的是將各種熒光染料發(fā)射的光子收集到獨立的檢測通道中。為此，有必要對全發(fā)射光譜的組分進行空間分離，即將這些組分定位到不同的方向。傳統(tǒng)上，這種分離是通過“次級二向色鏡"（將照明與發(fā)射分離的主要分光器，稱“主分光器"）進行的。出乎意料的是，還可以通過使用棱鏡或光柵來分離。根據(jù)光子的顏色對光子進行物理分類，這是一種原始的真彩分色方法。如果主要分色不充分，則可以通過數(shù)學分解來補充。

次級二向色鏡
自1970年以來，多通道熒光顯微技術在生物顯微技術領域的需求日益增加。在簡單的情況下，用于單通道設置的濾光片和二向色鏡在本質上允許記錄例如，藍色或紫外線激發(fā)下的綠色和黃色/橙色熒光（當時被遺忘的標準是富爾根染色，它可以通過不同的發(fā)射顏色來辨別和）。寬場顯微技術通過使用彩色攝像機來達到這一要求。有時，特別是對于定量測量，圖像被分割，兩個通道在同一芯片上并行成像。先進的是同時并行使用兩個或多個攝像機。在真共聚焦掃描顯微技術中，不可能分割感應目標。因此，通過添加第二個（第三個……）光電倍增管，立即實現(xiàn)了多通道熒光成像。并行記錄數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)可以直接顯示在屏幕上，例如，在監(jiān)視器的3個顏色通道中，或以電子方式存儲以供以后分析。要顯示3個以上的通道，信息必須分布在3個可用的監(jiān)視器通道中，這不可避免地會導致分離度和強度分辨率的損失。然而，現(xiàn)代顯微技術不僅僅能得到清晰的圖像（無論如何，我們用肉眼只能辨別三個通道），還可以對其進行定量測量。在定量測量中，只要通道數(shù)量不超過樣品中熒光染料物質的數(shù)量，任何數(shù)量的通道都是有意義的。
 

 
圖1：帶有次級二向色鏡的4通道共聚焦掃描顯微鏡的布局圖（徠卡 ，1995年）。1和2設計為“濾光片輪"，而是固定反射鏡（適用于3通道系統(tǒng)）或固定二向色鏡（適用于4通道系統(tǒng)）。
 
將發(fā)射不同顏色的熒光染料發(fā)射到一組傳感器，最顯而易見的方法是使用二向色鏡。二向色鏡會反射比二向色原定波長₀更短波長的光，并能透射更長波長的所有顏色的光。這適用于“長通二向色鏡"?！岸掏ǘ蛏R"會透射較短波長的光并反射光譜中較紅部分的光。在圖2中，一組三個次級二向色鏡₁、₂和₃用于將全光譜分成4個不同的方向，傳感器隨后可以在其中收集4個不同的通道。必須根據(jù)所用熒光染料的光譜發(fā)射特性來選擇次級二向色鏡。因此，給定的一組次級二向色鏡可能適合許多發(fā)射方式類似的熒光染料，但如果熒光染料組合的發(fā)射特性顯著不同，則不適用。為解決這一問題，使用次級二向色鏡進行分色的系統(tǒng)在每個分色位置都配備了片輪或滑塊。它們配備了一系列不同的二向色鏡，允許（有限）數(shù)量的不同色帶傳遞給傳感器。顯然，這種解決方案不是很靈活，需要大量的伺服技術和調整（預計至少保持穩(wěn)定數(shù)月。如果安裝許多激光線，則潛在發(fā)射帶的數(shù)量將會增加——因此需要的次級二向色鏡的數(shù)量也會增加。如果使用白激光，發(fā)射濾光片概念將無法合理適應，只能使用連續(xù)可調的設備。圖1表明了1995年次級二向色概念的實現(xiàn)。
 

 
圖2：二向色鏡的色散。主分光器將激發(fā)與發(fā)射分離。隨后通過次級二向色鏡1、2和3將發(fā)射分成四個方向（本例）。常規(guī)二向色鏡反射短波長的光并透射“更紅"顏色的光，盡管相反的特性也同樣可能。
 
 
棱鏡的色散

 
圖3：基于棱鏡的共聚焦檢測模塊示意圖，該模塊具有可單獨調節(jié)波段的5個通道，用于發(fā)射收集。
1）棱鏡，2）滑塊，3）檢測器
 
 
 
艾薩克·牛頓爵士在其1704年出版的《光學》一書中描述了最古老的（有目的的）光分色方法：使用棱鏡。本文的序言部分附有牛頓那本書的插圖。我們如今的解釋是，在不同光學介質的邊界處，較短波長的光將比較長波長的光的衍射更強（作出一個簡單的結論）。如果將不同顏色混合后（如一組熒光染料組合發(fā)射），穿過棱鏡，則組合發(fā)射將在光譜上分解。
 
分解強度取決于多個技術參數(shù)，但與樣品或傳感器無關。這是一個非常有效和直接的解決方案，可以讓一組熒光染料發(fā)射指向不同方向，這樣就可以記錄下來。在簡單的情況下，只需沿著光譜放置一系列檢測器。這一概念已經實現(xiàn)了，但在收集效率和靈活性方面還存在嚴重缺陷。多波段設備是更好的解決方案，對每個要記錄的傳感器，其允許單獨選擇全光譜的任何部分。
 
棱鏡具有全光譜（平面）透射的優(yōu)勢，即棱鏡（在原定的光譜范圍內）沒有吸收調制。透射和色散與偏振方向無關。這是一個重要的定律，因為熒光染料的發(fā)射總是非偏振的。最后但并非最不重要的是，色散僅發(fā)生在一個方向上——在選擇的階數(shù)中，沒有其他“階數(shù)"可以降低色散的強度。
 
本文對色散光譜的線性問題進行了討論?；诶忡R的光譜與波長不呈線性關系。這對于技術設計而言不是問題，只要不使用線性檢測器組合，例如多陽極光電倍增管或類似設備。

 
圖4：棱鏡的色散。由于玻璃棱鏡的折射能力取決于衍射光的波長，因此不同波長的組合將被分散。在白光的情況下，色散圖案是一個連續(xù)的光譜。多重標記熒光樣品的發(fā)射將產生一個在熒光染料發(fā)射最大值處具有最大值的光譜。這一技術是通過單個傳感器收集盡可能多的單一染料。
 
 
光柵色散

 
圖5：光柵與棱鏡的效率比較。光柵（藍色曲線）針對“閃耀"波長進行了優(yōu)化，該波長兩側的效率都會下降。而且，特定的偏振方向的透過效率很好（在閃耀時）。在短波段內，垂直偏振顯著下降。棱鏡的效率主要取決于所使用的玻璃類型，并且在長程范圍內是平面且非偏振的（此處：用于可見光發(fā)射的冕玻璃）。
 
 
棱鏡的另一個色散元件是光柵。透射光柵和反射光柵都在使用。用入射光束照明時，光柵的周期性結構將使光偏轉到不同方向（通過干涉過程）。
 
直線方向（0階）不顯示任何色散。通常選擇的方向是一階。在這里，光分散為光譜，非常類似于棱鏡中的色散。然而，還有更多的階數(shù)，如2階和更高階，但在光柵法線的另一側，也有反射1階……階。光柵制作技術是將盡可能多的能量集中在一個單一的階數(shù)中。
 
對于平行或垂直于線（凹槽）方向的偏振光，光柵的表現(xiàn)也迥然不同。雖然垂直波在最佳情況（取決于各種參數(shù)）下可以產生相當有效的光譜，但平行波在距離閃耀波長兩個八度范圍內顯著下降——大約降為零。由于熒光是非偏振的，因此用垂直效率和平行效率的平均值來描述總效率。在可見光200 范圍內，下降到30%是常見的。
 
對于效率（光子收集性能）是關鍵問題的儀器而言，這使得光柵成為非常低效且不合適的色散器件——在共聚焦熒光顯微技術中也是如此。如果該技術實現(xiàn)，通常會附加一系列額外的設計元件，試圖引導丟失的光子進入傳感器（有時稱為“光子回收器"）。
 
更復雜的是，與棱鏡相比，光柵的雜散光損失要大得多。

 
圖6：光柵產生包含入射光束光譜的若干階數(shù)。通過所用的階數(shù)與入射光束的比值來計算絕對效率。
 
 
色散器的比較
如上文所述，在共聚焦顯微技術中，熒光發(fā)射色散的各種概念各有優(yōu)缺點。比較概述如下表所示。顯然，棱鏡是完成這項任務的*。
 

了解更多：徠卡顯微