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概述
熒光顯微鏡的基本原理是借助熒光染料對細(xì)胞成分進(jìn)行高度特異性的可視化觀察。這可能是一種與興趣蛋白質(zhì)遺傳相關(guān)的熒光蛋白，如綠色熒光蛋白（GFP）等。如果克隆無法實(shí)現(xiàn)，例如在組織學(xué)樣本上無法實(shí)現(xiàn)，則需要使用另一種技術(shù)如免疫熒光染色來對興趣蛋白質(zhì)進(jìn)行可視化觀察。為此，人們使用抗體來連接不同的熒光染料并將其直接或間接地結(jié)合到適當(dāng)?shù)陌悬c(diǎn)上。此外，借助熒光染料，熒光顯微鏡的應(yīng)用就不再僅局限于蛋白質(zhì)觀察，還能對核酸、多糖和其他結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色，甚至像鈣離子這樣的非生物物質(zhì)也能被檢出。本文就為大家介紹了幾種常用的熒光染料。
免疫熒光
在熒光顯微鏡下，有兩種方法可以顯示興趣蛋白質(zhì)?？梢越柚鷥?nèi)在的熒光信號，也就是通過克隆從而在基因?qū)用姘岩粋€(gè)熒光蛋白和一個(gè)靶蛋白聯(lián)系起來；又或者借助熒光標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合到興趣蛋白質(zhì)上。對于某些生物學(xué)問題來說，后者更為實(shí)用甚至更為必要。例如，在組織學(xué)樣本的情況下，通常樣本來自不含任何熒光蛋白的生物體，所以不可能使用熒光蛋白。此外，如果有功能性抗體可用，免疫熒光比熒光蛋白技術(shù)要快得多，因?yàn)闊晒獾鞍追椒ū仨毧寺∨d趣基因并將DNA轉(zhuǎn)染到相應(yīng)細(xì)胞中。熒光蛋白的另一個(gè)缺點(diǎn)在于其本身就是一種蛋白質(zhì)。因此細(xì)胞內(nèi)就具備了特定的蛋白質(zhì)特性，因而可能導(dǎo)致功能紊亂或?qū)λY(jié)合的興趣蛋白產(chǎn)生干擾。當(dāng)然，值得注意的是，熒光蛋白通常是觀察活細(xì)胞的方法。
免疫熒光利用抗體對抗原的特異性結(jié)合親和力。此處可存在兩種不同的結(jié)構(gòu)。簡單的方法是使用一種熒光標(biāo)記的抗體，該抗體與興趣蛋白結(jié)合，稱為直接免疫熒光。
大多數(shù)情況下會使用兩種形式的抗體。第1抗體與靶蛋白結(jié)合，自身（1st抗體）沒有熒光標(biāo)記。但與第1抗體結(jié)合的第2抗體（2nd抗體）特異性攜帶熒光染料，這種方法被稱為間接免疫熒光。間接免疫熒光有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，一方面會存在放大效應(yīng)，因?yàn)椴恢褂幸环N第2抗體與一種第1抗體結(jié)合。另一方面，針對您興趣蛋白，不需要一直用熒光染料標(biāo)記每種抗體，可以使用市售熒光標(biāo)記的第2抗體。免疫熒光中廣泛使用的熒光染料是FITC、TRITC或以下提到的幾種Alexa Fluor®染料。
FITC和TRITC
異硫氰酸熒光素（FITC）是一種有機(jī)熒光染料，目前仍用于免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)當(dāng)中。該染料在495/517nm處存在激發(fā)/發(fā)射峰，而且可借助其反應(yīng)性異硫氰酸酯基團(tuán)與蛋白質(zhì)上的氨基、巰基、咪唑基、酪氨酰或羰基結(jié)合而與不同的抗體偶聯(lián)。它的基本結(jié)構(gòu)，即熒光黃的分子量為332g/mol，常用作熒光示蹤劑。FITC（389g/mol）是最早用于熒光顯微術(shù)的染料之一，也是Alexa-fluor488等熒光染料的來源。它的熒光活性源于其自身的大共軛芳香電子結(jié)構(gòu)，在藍(lán)色光譜中會被光所激發(fā)。
圖 1： 果蠅胚胎發(fā)育，綠色： FITC，紅色： TRITC。
經(jīng)常與FITC配合使用的一種染料是同出一門的TRITC（四甲基羅丹明-5-（和6）-異硫氰酸酯）。與FITC不同，TRITC不是熒光素，而是羅丹明系列衍生物。羅丹明也存在一個(gè)大的共軛芳香電子結(jié)構(gòu)，因此可以發(fā)出熒光。與FITC不一樣，TRITC（479g/mol）在綠色光譜中被激發(fā)，最大值出現(xiàn)在550nm處，最大發(fā)射波長為573nm。與蛋白質(zhì)（如抗體）的結(jié)合也基于反應(yīng)性異硫氰酸酯基團(tuán)。
即使FITC和TRITC仍在使用，但考慮到兩者屬于相當(dāng)弱的熒光染料，不建議用于先進(jìn)的顯微術(shù)。兩者的優(yōu)勢主要還是在于成本低。
花青素
這種相對較小的熒光染料集合源于花青素并因此而得名：Cy2、Cy3、Cy5和Cy7。這些染料都可以通過反應(yīng)基團(tuán)與核酸或蛋白質(zhì)相連。例如，蛋白質(zhì)標(biāo)記使用馬來酰胺基團(tuán)。有趣的是，熒光方面Cy5對周圍的電子環(huán)境很敏感，這可用于酶的測定。黏附蛋白的構(gòu)象變化導(dǎo)致熒光發(fā)射的正負(fù)變化。此外，Cy3和Cy5可用于FRET實(shí)驗(yàn)?；ㄇ嗨厝玖鲜潜容^古老的熒光染料，也是其它熒光染料的基礎(chǔ)，具有亮度高、光穩(wěn)定性好、量子效率高等優(yōu)點(diǎn)。
圖 2： 小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎、肢間體節(jié)、E10.5小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎的5個(gè)肢間體節(jié)： EpaxialMyf5 eGFP；GFP-Alexa 488免疫組化染色；用Desmin-Cy3對胚胎肌肉纖維進(jìn)行染色，用Hoechst揭示細(xì)胞核，自上而下尺寸： 3.5毫米 (a)、800微米 (b)。 樣本提供： Aurélie Jory，法國巴黎巴斯德研究院干細(xì)胞與發(fā)育以及遺傳與分子細(xì)胞生物學(xué)研究所 (IGBMC) 成像中心
圖 3： 小鼠成纖維細(xì)胞，綠色： F-Actin、FITC，紅色： Tubulin、Cy5，藍(lán)色： 細(xì)胞核，DAPI。 樣本提供： 德國海德堡馬克斯-普朗克醫(yī)學(xué)研究所 Günter Giese 博士
DNA染色處理
在熒光顯微術(shù)中，不僅蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)感興趣，而且對核酸也感興趣。有時(shí)有必要通過檢測細(xì)胞核來確定細(xì)胞的確切位置或數(shù)量。最常見的DNA染色劑之一是DAPI（4',6-二氨基-2-苯基吲哚），主要與DNA雙螺旋富含A-T的區(qū)域結(jié)合。與未結(jié)合態(tài)相比，DAPI在DNA上的熒光強(qiáng)度增加。染料被UV（紫外線）光激發(fā)，最大激發(fā)波長為358nm。發(fā)射光譜較寬，峰值在461nm。弱熒光也可以檢測到RNA結(jié)合。在這種情況下，發(fā)射轉(zhuǎn)移到500nm。有趣的是，DAPI能夠滲透完整的細(xì)胞膜。因此，該染料既可用于固定細(xì)胞也可用于活細(xì)胞。
第二種廣泛使用的DNA染色方法是Hoechst染料，最初由化學(xué)公司Hoechst AG生產(chǎn)。Hoechst 33258、Hoechst 33342和Hoechst 34580都是鄰苯二甲酰亞胺，具有向A-T富集區(qū)插入的趨勢，因此后者不常使用。與DAPI相似，此類染料受到紫外線激發(fā)并在455 nm下發(fā)射最大值，在無結(jié)合狀態(tài)下變?yōu)?10–540 nm。Hoechst染料還具有細(xì)胞滲透作用，因此可用于固定細(xì)胞和活細(xì)胞。與DAPI不同是，Hoechst染料毒性更低。
DNA染色劑碘化丙啶無法透過細(xì)胞膜。在細(xì)胞培養(yǎng)中，因?yàn)樵撊旧珓o法進(jìn)入完好的細(xì)胞內(nèi)，所以常常被用來區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。碘化丙啶也是一種結(jié)合劑，但對不同的堿基沒有特異性。在核酸結(jié)合態(tài)下，其最大激發(fā)波長為538nm，最高發(fā)射波長為617nm。未結(jié)合狀態(tài)下碘化丙啶的最大激發(fā)和發(fā)射被移到較短的波長和較弱的強(qiáng)度。它也可以在不改變其熒光特性的情況下與RNA結(jié)合。要區(qū)分DNA和RNA，必須使用足夠的聚合酶。
吖啶橙是一種染料，可以在DNA和RNA之間形成差異區(qū)分而無需事先操作。其最大激發(fā)/發(fā)射對在DNA結(jié)合態(tài)為502nm/525nm，在RNA結(jié)合態(tài)為460nm/650nm。此外，該染料還可以進(jìn)入酸性間室中，如溶酶體。陽離子染料在酸性間室中質(zhì)子化。在酸性環(huán)境中，吖啶橙受藍(lán)色光譜中的光激發(fā)，而橙色區(qū)域的發(fā)射*。因?yàn)榈蛲黾?xì)胞有很多被吞噬的酸性間室，因此也讓該染料成為了這類細(xì)胞常用的標(biāo)記物。
間室與細(xì)胞器特異性染料
在熒光顯微鏡下，對細(xì)胞間室如溶酶體或核內(nèi)體和細(xì)胞器如線粒體等進(jìn)行染色通常較為合理。為此，本節(jié)將介紹一組特定染料組合。
觀察線粒體時(shí)一種*的方法是使用MitoTracker®。這是一種細(xì)胞滲透性染料，具有溫和的巰基活性氯甲基部分。該染料可以通過與半胱氨酸殘基的自由巰基反應(yīng)，與基質(zhì)蛋白共價(jià)結(jié)合。MitoTracker®有不同的顏色和改良成分（見表1），也是Molecular Probes的商標(biāo)。與傳統(tǒng)的線粒體特異性染色劑如羅丹明123或四甲基玫瑰胺不同的是，在用固定劑破壞膜電位后MitoTracker®不會被洗掉。
根據(jù)線粒體染色情況，還有染料標(biāo)記酸性間室如溶酶體等，稱為LysoTracker。這些是與熒光團(tuán)相連的膜滲透性弱堿。由于質(zhì)子化作用，這些堿很有可能與酸性間室有親和力。LysoTracker也有不同的顏色（見表1）。
與溶酶體類似的間室為真菌液泡，如釀酒酵母。這種薄膜包圍的空間也具有酸性。在熒光顯微鏡下觀察它的方法之一是使用苯乙烯基染料，如FM 4-64®或FM 5-95®。
在蛋白質(zhì)分泌實(shí)驗(yàn)方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）尤為值得注意。對這種間室進(jìn)行染色的一種經(jīng)典染料是DiOC6(3)。這種染料雖然偏向與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合，但也能與線粒體膜等其他膜結(jié)合。另一種特定染色ER的方法是使用ER-Tracker，如綠色和紅色ER-Tracker。這兩種染料都是以BODIPY為基礎(chǔ)的染料，與格列本脲（一種磺酰脲酶）有關(guān)，能與ER膜上*的ATP敏感鉀通道結(jié)合。BODIPY（硼二吡咯甲基）描述了一組相對pH不敏感的染料，這些染料幾乎都不溶于水。這類染料并不是很好的蛋白質(zhì)標(biāo)記工具，但用于脂質(zhì)和膜標(biāo)記時(shí)效果較佳。
ER相近間室 – 高爾基體 – 可用熒光神經(jīng)酰胺類似物如 NBD C6-神經(jīng)酰胺和BODIPY FL C5-神經(jīng)酰胺進(jìn)行標(biāo)示。神經(jīng)酰胺是高爾基體中所富含的鞘脂。
在進(jìn)一步脂質(zhì)基染料的幫助下還有可能對特殊的膜區(qū)域，如脂質(zhì)筏等進(jìn)行染色。這些富含膽固醇的結(jié)構(gòu)域可以通過使用NBD-6膽固醇或NBP-12膽固醇等（Avanti極性脂質(zhì)）來進(jìn)行可視化觀察。
除了使用特殊的非蛋白熒光染料來標(biāo)記細(xì)胞間室外，還可以借助于對細(xì)胞中不同位置有偏好的蛋白質(zhì)來染色興趣區(qū)域。這些蛋白質(zhì)可以連接到熒光染料上，并在熒光顯微鏡下顯示出來。這種方法的一個(gè)例子是小麥胚芽凝集素（WGA）的使用，它與存在于質(zhì)膜中的唾液酸和N-乙酰氨基葡萄糖基特異結(jié)合。WGA與熒光染料偶聯(lián)。用它可以觀察到質(zhì)膜。
圖 4： Pukinje細(xì)胞，三色標(biāo)記的小鼠小腦皮質(zhì)矢狀切片。 紅色：anti-calbindin-D28k/Cy3，綠色：anti-GFAP/Cy5，藍(lán)色： Hoechst 33258
圖 5： 牛肺內(nèi)皮細(xì)胞。 紅色： MitoTracker® Red CMXRos 標(biāo)記的線粒體，綠色： 綠色熒光BODIPY® FL phallacidin標(biāo)記的纖維狀肌動蛋白，藍(lán)色： DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核。 此圖像采用3D盲反卷積方法提高了圖像質(zhì)量
ER相近間室 – 高爾基體 – 可用熒光神經(jīng)酰胺類似物如NBD C6-神經(jīng)酰胺和BODIPY FL C5-神經(jīng)酰胺進(jìn)行標(biāo)記。 神經(jīng)酰胺是高爾基體中所富含的鞘脂。
在其他脂質(zhì)基染料的幫助下還可以對特殊的膜區(qū)域如脂質(zhì)筏等進(jìn)行染色。 這些富含膽固醇的結(jié)構(gòu)域可以通過使用NBD-6 膽固醇或NBP-12 膽固醇等（Avanti極性脂質(zhì)）來進(jìn)行可視化觀察。
還可以借助于對細(xì)胞中不同位置有偏好的蛋白質(zhì)來染色感興趣區(qū)域。 這種方法的一個(gè)例子是小麥胚芽凝集素(WGA)的使用，它與存在于質(zhì)膜中的唾液酸和N-乙酰氨基葡萄糖基特異結(jié)合。
功能實(shí)驗(yàn)
“功能實(shí)驗(yàn)"是一個(gè)統(tǒng)稱，指的是評估各種功能的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)，這些功能可以用熒光標(biāo)志物進(jìn)行可視化觀察。 這些標(biāo)志物包括但不限于上述任何標(biāo)記技術(shù)和熒光團(tuán)。 對于其中的許多功能實(shí)驗(yàn)而言，染色試劑盒可在市場上買到，并且可以輕松用于各種樣本。 功能實(shí)驗(yàn)的一個(gè)例子是大家都知道且廣泛使用的活細(xì)胞/死細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。 兩個(gè)熒光團(tuán)分別用于標(biāo)記活細(xì)胞和死細(xì)胞。 在同時(shí)掌握這兩個(gè)值的情況下，就可以評估細(xì)胞的總體健康狀況。 將此信息與其他標(biāo)志物關(guān)聯(lián)起來還可以加深對底層過程的理解。
熒光染料及其激發(fā)和發(fā)射波長峰值
以上提到的全部染料都在下表中列出。此外，表中還提到了其他熒光染料及其激發(fā)和發(fā)射的波長峰值。
圖 6： Alexa 488（綠色曲線）和 Alexa 555（黃色曲線）的熒光發(fā)射曲線。 兩個(gè)發(fā)射光譜的重疊顯而易見。 紅線表示 488 發(fā)射光濾光鏡的帶通。
表1
| 熒光染料樣本示例 | 激發(fā) | 發(fā)射 |
| Indo-1, Ca saturated | 331 nm | 404 nm |
| Indo-1 Ca2+ | 346 nm | 404 nm |
| Cascade Blue BSA pH 7.0 | 401 nm | 419 nm |
| Cascade Blue | 398 nm | 420 nm |
| LysoTracker Blue | 373 nm | 421 nm |
| Alexa 405 | 401 nm | 421 nm |
| LysoSensor Blue pH 5.0 | 374 nm | 424 nm |
| LysoSensor Blue | 374 nm | 424 nm |
| DyLight 405 | 399 nm | 434 nm |
| DyLight 350 | 332 nm | 435 nm |
| BFP（藍(lán)色熒光蛋白） | 380 nm | 439 nm |
| Alexa 350 | 343 nm | 441 nm |
| 7-氨基-4-甲基豆素pH 7.0 | 346 nm | 442 nm |
| 氨基豆素 | 345 nm | 442 nm |
| AMCA共軛物 | 347 nm | 444 nm |
| 豆素 | 360 nm | 447 nm |
| 7-羥基-4-甲基豆素 | 360 nm | 447 nm |
| 7-羥基-4-甲基豆素pH 9.0 | 361 nm | 448 nm |
| 6.8-二氟-7-羥基-4-甲基豆素pH 9.0 | 358 nm | 450 nm |
| Hoechst 33342 | 352 nm | 455 nm |
| Pacific Blue | 404 nm | 455 nm |
| Hoechst 33258 | 352 nm | 455 nm |
| Hoechst 33258-DNA | 352 nm | 455 nm |
| Pacific Blue抗體共軛物pH 8.0 | 404 nm | 455 nm |
| PO-PRO-1 | 434 nm | 457 nm |
| PO-PRO-1-DNA | 435 nm | 457 nm |
| POPO-1 | 433 nm | 457 nm |
| POPO-1-DNA | 433 nm | 458 nm |
| DAPI-DNA | 359 nm | 461 nm |
| DAPI | 358 nm | 463 nm |
| Marina Blue | 362 nm | 464 nm |
| SYTOX Blue-DNA | 445 nm | 470 nm |
| CFP（青色熒光蛋白） | 434 nm | 474 nm |
| eCFP（增強(qiáng)型青色熒光蛋白） | 437 nm | 476 nm |
| 1-苯胺鄰苯二甲酸-8-磺酸（1,8-ANS） | 375 nm | 479 nm |
| Indo-1, Ca free | 346 nm | 479 nm |
| 1,8-ANS（1-苯胺鄰苯二甲酸-8-磺酸） | 375 nm | 480 nm |
| BO-PRO-1-DNA | 462 nm | 482 nm |
| BOPRO-1 | 462 nm | 482 nm |
| BOBO-1-DNA | 461 nm | 484 nm |
| SYTO 45-DNA | 451 nm | 486 nm |
| evoglow-Pp1 | 448 nm | 495 nm |
| evoglow-Bs1 | 448 nm | 496 nm |
| evoglow-Bs2 | 448 nm | 496 nm |
| Auramine O | 431 nm | 501 nm |
| DiO | 487 nm | 501 nm |
| LysoSensor Green pH 5.0 | 447 nm | 502 nm |
| Cy 2 | 489 nm | 503 nm |
| LysoSensor Green | 447 nm | 504 nm |
| Fura-2, high Ca | 336 nm | 504 nm |
| Fura-2 Ca2+sup> | 336 nm | 505 nm |
| SYTO 13-DNA | 488 nm | 506 nm |
| YO-PRO-1-DNA | 491 nm | 507 nm |
| YOYO-1-DNA | 491 nm | 509 nm |
| eGFP（增強(qiáng)型青色熒光蛋白） | 488 nm | 509 nm |
| LysoTracker Green | 503 nm | 509 nm |
| GFP (S65T) | 489 nm | 509 nm |
| BODIPY FL, MeOH | 502 nm | 511 nm |
| Sapphire | 396 nm | 511 nm |
| BODIPY FL共軛物 | 503 nm | 512 nm |
| MitoTracker Green | 490 nm | 512 nm |
| MitoTracker Green FM, MeOH | 490 nm | 512 nm |
| 熒光素0.1 M NaOH | 493 nm | 513 nm |
| 鈣黃綠素pH 9.0 | 494 nm | 514 nm |
| 熒光素pH 9.0 | 490 nm | 514 nm |
| 鈣黃綠素 | 493 nm | 514 nm |
| Fura-2, no Ca | 367 nm | 515 nm |
| Fluo-4 | 494 nm | 516 nm |
| FDA | 495 nm | 517 nm |
| DTAF | 495 nm | 517 nm |
| 熒光素 | 495 nm | 517 nm |
| 熒光素抗體共軛物 pH 8.0 | 493 nm | 517 nm |
| CFDA | 495 nm | 517 nm |
| FITC | 495 nm | 517 nm |
| Alexa Fluor 488肼類-水 | 493 nm | 518 nm |
| DyLight 488 | 493 nm | 518 nm |
| 5-FAM pH 9.0 | 492 nm | 518 nm |
| FITC抗體共軛物pH 8.0 | 495 nm | 519 nm |
| Alexa 488 | 493 nm | 520 nm |
| 羅丹明110 | 497 nm | 520 nm |
| 羅丹明110 pH 7.0 | 497 nm | 520 nm |
| 吖啶橙 | 431 nm | 520 nm |
| Alexa Fluor 488抗體共軛物 pH 8.0 | 499 nm | 520 nm |
| BCECF pH 5.5 | 485 nm | 521 nm |
| PicoGreendsDNA量化試劑 | 502 nm | 522 nm |
| SYBR Green I | 498 nm | 522 nm |
| 羅丹明Green pH 7.0 | 497 nm | 523 nm |
| CyQUANT GR-DNA | 502 nm | 523 nm |
| NeuroTrace 500/525，綠色熒光 Nissl染色-RNA | 497 nm | 524 nm |
| DansylCadaverine | 335 nm | 524 nm |
| Rhodol Green抗體共軛物 pH 8.0 | 499 nm | 524 nm |
| Fluoro-Emerald | 495 nm | 524 nm |
| Nissl | 497 nm | 524 nm |
| 熒光素葡聚糖pH 8.0 | 501 nm | 524 nm |
| 羅丹明綠色 | 497 nm | 524 nm |
| 5-（和-6）-羧基-2'，7'-二氯熒光素pH 9.0 | 504 nm | 525 nm |
| DansylCadaverine, MeOH | 335 nm | 526 nm |
| eYFP （增強(qiáng)型黃色熒光蛋白） | 514 nm | 526 nm |
| Oregon Green 488 | 498 nm | 526 nm |
| Oregon Green 488抗體共軛物 pH 8.0 | 498 nm | 526 nm |
| Fluo-3 | 506 nm | 527 nm |
| BCECF pH 9.0 | 501 nm | 527 nm |
| SBFI-Na+ | 336 nm | 527 nm |
| Fluo-3 Ca2+ | 506 nm | 527 nm |
| 羅丹明123, MeOH | 507 nm | 529 nm |
| FlAsH | 509 nm | 529 nm |
| 鈣綠-1 Ca2+ | 506 nm | 529 nm |
| 鎂綠 | 507 nm | 530 nm |
| DM-NERF pH 4.0 | 493 nm | 530 nm |
| 鈣綠 | 506 nm | 530 nm |
| 檸檬黃 | 515 nm | 530 nm |
| LysoSensor Yellow pH 9.0 | 335 nm | 530 nm |
| TO-PRO-1-DNA | 515 nm | 531 nm |
| 鎂綠Mg2+ | 507 nm | 531 nm |
| 鈉綠Na+ | 507 nm | 531 nm |
| TOTO-1-DNA | 514 nm | 531 nm |
| Oregon Green 514 | 512 nm | 532 nm |
| Oregon Green 514抗體共軛物 pH 8.0 | 513 nm | 533 nm |
| NBD-X | 466 nm | 534 nm |
| DM-NERF pH 7.0 | 509 nm | 537 nm |
| NBD-X, MeOH | 467 nm | 538 nm |
| CI-NERF pH 6.0 | 513 nm | 538 nm |
| Alexa 430 | 431 nm | 540 nm |
| Alexa Fluor 430抗體共軛物 pH 7.2 | 431 nm | 540 nm |
| CI-NERF pH 2.5 | 504 nm | 541 nm |
| Lucifer Yellow, CH | 428 nm | 542 nm |
| LysoSensor Yellow pH 3.0 | 389 nm | 542 nm |
| 6-TET, SE pH 9.0 | 521 nm | 542 nm |
| Eosin抗體共軛物 pH 8.0 | 525 nm | 546 nm |
| Eosin | 524 nm | 546 nm |
| 6-Carboxy羅丹明6G pH 7.0 | 526 nm | 547 nm |
| 6-Carboxy羅丹明6G, hydrochloride | 525 nm | 547 nm |
| Bodipy R6G SE | 528 nm | 547 nm |
| BODIPY R6G, MeOH | 528 nm | 547 nm |
| 6 JOE | 520 nm | 548 nm |
| Cascade Yellow抗體共軛物 pH 8.0 | 399 nm | 549 nm |
| Cascade Yellow | 399 nm | 549 nm |
| mBanana | 540 nm | 553 nm |
| Alexa Fluor 532抗體共軛物 pH 7.2 | 528 nm | 553 nm |
| Alexa 532 | 528 nm | 553 nm |
| Erythrosin-5-isothiocyanate pH 9.0 | 533 nm | 554 nm |
| 6-HEX, SE pH 9.0 | 534 nm | 559 nm |
| mOrange | 548 nm | 562 nm |
| mHoneydew | 478 nm | 562 nm |
| Cy 3 | 549 nm | 562 nm |
| 羅丹明B | 543 nm | 565 nm |
| DiI | 551 nm | 565 nm |
| 5-TAMRA-MeOH | 543 nm | 567 nm |
| Alexa 555 | 553 nm | 568 nm |
| Alexa Fluor 555抗體共軛物 pH 7.2 | 553 nm | 568 nm |
| DyLight 549 | 555 nm | 569 nm |
| BODIPY TMR-X, SE | 544 nm | 570 nm |
| BODIPY TMR-X, MeOH | 544 nm | 570 nm |
| PO-PRO-3-DNA | 539 nm | 571 nm |
| PO-PRO-3 | 539 nm | 571 nm |
| 羅丹明 | 551 nm | 573 nm |
| Bodipy TMR-X conjugate | 544 nm | 573 nm |
| POPO-3 | 533 nm | 573 nm |
| Alexa 546 | 562 nm | 573 nm |
| BODIPY TMR-X抗體共軛物 pH 7.2 | 544 nm | 573 nm |
| Calcium Orange Ca2+ | 549 nm | 573 nm |
| TRITC | 550 nm | 573 nm |
| Calcium Orange | 549 nm | 574 nm |
| 羅丹明鬼筆環(huán)肽 pH 7.0 | 558 nm | 575 nm |
| MitoTracker Orange | 551 nm | 575 nm |
| MitoTracker Orange, MeOH | 551 nm | 575 nm |
| 藻紅蛋白 | 565 nm | 575 nm |
| 鎂橙 | 550 nm | 575 nm |
| R-藻紅蛋白pH 7.5 | 565 nm | 576 nm |
| 5-TAMRA pH 7.0 | 553 nm | 576 nm |
| 5-TAMRA | 549 nm | 577 nm |
| Rhod-2 | 552 nm | 577 nm |
| FM 1-43 | 472 nm | 578 nm |
| Rhod-2 Ca2+ | 553 nm | 578 nm |
| 四甲羅丹明抗體共軛物 pH 8.0 | 552 nm | 578 nm |
| FM 1-43 lipid | 473 nm | 579 nm |
| LOLO-1-DNA | 568 nm | 580 nm |
| dTomato | 554 nm | 581 nm |
| DsRed | 563 nm | 581 nm |
| Dapoxyl (2-aminoethyl) sulfonamide | 372 nm | 582 nm |
| 四甲羅丹明dextran pH 7.0 | 555 nm | 582 nm |
| Fluor-Ruby | 554 nm | 582 nm |
| Resorufin | 571 nm | 584 nm |
| Resorufin pH 9.0 | 571 nm | 584 nm |
| mTangerine | 568 nm | 585 nm |
| LysoTracker Red | 578 nm | 589 nm |
| Lissamine羅丹明 | 572 nm | 590 nm |
| Cy 3.5 | 578 nm | 591 nm |
| 羅丹明Red-X抗體共軛物 pH 8.0 | 573 nm | 591 nm |
| Sulfo羅丹明101, EtOH | 578 nm | 593 nm |
| JC-1 pH 8.2 | 593 nm | 595 nm |
| JC-1 | 592 nm | 595 nm |
| mStrawberry | 575 nm | 596 nm |
| MitoTracker Red | 578 nm | 599 nm |
| MitoTracker Red, MeOH | 578 nm | 599 nm |
| X-Rhod-1 Ca2+ | 580 nm | 602 nm |
| Alexa Fluor 568抗體共軛物 pH 7.2 | 579 nm | 603 nm |
| Alexa 568 | 576 nm | 603 nm |
| 5-ROX pH 7.0 | 578 nm | 604 nm |
| 5-ROX（5-羥基-X-羅丹明，三乙基銨鹽） | 578 nm | 604 nm |
| BO-PRO-3-DNA | 574 nm | 604 nm |
| BOPRO-3 | 574 nm | 604 nm |
| BOBO-3-DNA | 570 nm | 605 nm |
| 溴化乙錠 | 524 nm | 605 nm |
| ReAsH | 597 nm | 608 nm |
| 鈣深紅 | 589 nm | 608 nm |
| 鈣深紅Ca2+ | 590 nm | 608 nm |
| mRFP | 585 nm | 608 nm |
| mCherry | 587 nm | 610 nm |
| Texas Red-X抗體共軛物 pH 7.2 | 596 nm | 613 nm |
| HcRed | 590 nm | 614 nm |
| DyLight 594 | 592 nm | 616 nm |
| 乙二胺同二聚體-1-DNA | 528 nm | 617 nm |
| 乙二胺同二聚體 | 528 nm | 617 nm |
| 碘化丙啶 | 538 nm | 617 nm |
| SYPRO Ruby | 467 nm | 618 nm |
| 碘化丙啶-DNA | 538 nm | 619 nm |
| Alexa 594 | 590 nm | 619 nm |
| BODIPY TR-X, SE | 588 nm | 621 nm |
| BODIPY TR-X, MeOH | 588 nm | 621 nm |
| BODIPY TR-X 鬼筆環(huán)肽pH 7.0 | 590 nm | 621 nm |
| YO-PRO-3-DNA | 613 nm | 629 nm |
| Di-8 ANEPPS | 469 nm | 630 nm |
| Di-8-ANEPPS-lipid | 469 nm | 631 nm |
| YOYO-3-DNA | 612 nm | 631 nm |
| Nile Red-lipid | 553 nm | 636 nm |
| Nile Red | 559 nm | 637 nm |
| DyLight 633 | 624 nm | 646 nm |
| mPlum | 587 nm | 649 nm |
| TO-PRO-3-DNA | 642 nm | 657 nm |
| DDAO pH 9.0 | 648 nm | 657 nm |
| Fura Red, high Ca | 434 nm | 659 nm |
| 別藻藍(lán)蛋白pH 7.5 | 651 nm | 660 nm |
| APC (allophycocyanin) | 650 nm | 660 nm |
| Nile Blue, EtOH | 631 nm | 660 nm |
| TOTO-3-DNA | 642 nm | 661 nm |
| Cy 5 | 646 nm | 664 nm |
| BODIPY 650/665-X, MeOH | 646 nm | 664 nm |
| Alexa Fluor 647 R-藻菊酯鏈霉親和素pH 7.2 | 569 nm | 666 nm |
| DyLight 649 | 652 nm | 668 nm |
| Alexa Fluor 647抗體共軛物 pH 7.2 | 653 nm | 668 nm |
| Alexa 647 | 653 nm | 669 nm |
| Fura Red Ca2+ | 435 nm | 670 nm |
| Atto 647 | 644 nm | 670 nm |
| Fura Red, low Ca | 472 nm | 673 nm |
| 羧萘熒光素pH 10.0 | 600 nm | 674 nm |
| Alexa 660 | 664 nm | 691 nm |
| Alexa Fluor 660抗體共軛物 pH 7.2 | 663 nm | 691 nm |
| Cy 5.5 | 673 nm | 692 nm |
| Alexa Fluor 680抗體共軛物 pH 7.2 | 679 nm | 702 nm |
| Alexa 680 | 679 nm | 703 nm |
| DyLight 680 | 678 nm | 706 nm |
| Alexa Fluor 700抗體共軛物 pH 7.2 | 696 nm | 719 nm |
| Alexa 700 | 696 nm | 720 nm |
| FM 4-64, 2% CHAPS | 506 nm | 751 nm |
| FM 4-64 | 508 nm | 751 nm |
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