什么是TauInteraction?
熒光顯微鏡是生命科學(xué)的重要研究工具之一，用于觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。熒光顯微鏡的一個關(guān)鍵優(yōu)勢在于能夠識別多個目標(biāo)，并能夠觀察他們之間的相互作用。
分子相互作用為細(xì)胞提供能量，將基因組信息轉(zhuǎn)化為細(xì)胞的各種結(jié)構(gòu)(Jacob F，Monod J.1961)。廣義地講，至少有三種類型的分子相互作用：核酸(DNA/RNA)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和小分子-蛋白質(zhì)(Zhang W et al. 2002, Schlessinger K et al. 2009, Yan L and Lamb RF 2011, Dunn JA et al. 2015, Pires BRB et al. 2018, Vidya MK et al. 2018)。
通過共振能量轉(zhuǎn)移(FRET，Förster 1960)實(shí)驗(yàn)可以確認(rèn)兩個分子之間發(fā)生相互作用。為了進(jìn)行FRET實(shí)驗(yàn)，被研究的分子中的一個被標(biāo)記了充當(dāng)“供體”的熒光探針，而另一個分子被標(biāo)記了充當(dāng)“受體”的探針。這樣的“供體-受體對”中供體的發(fā)射光譜和受體的激發(fā)光譜基本重疊。在這些條件下，如果兩個熒光團(tuán)彼此足夠接近(小于10 nm，Valeur 2001)并且方向合適(Pietraszewska-Bogieland Gadella 2011)時，則可能發(fā)生FRET。距離和分子方向?qū)Q定發(fā)生了多少FRET；我們用FRET效率來衡量它，也是量化分子相互作用的廣泛的方法(Valeur 2001)。報告FRET發(fā)生狀態(tài)的另一個值是相互作用供體(f_D，fraction of interacting donor)的比例，它對應(yīng)于在設(shè)定的時間內(nèi)有多少分子參與分子相互作用(Valeur 2001)。本質(zhì)上，來自供體熒光團(tuán)激發(fā)態(tài)的能量通過以非輻射方式(不發(fā)射光子)轉(zhuǎn)移到受體熒光團(tuán)。這一過程導(dǎo)致1)供體的熒光強(qiáng)度降低，2)受體的熒光強(qiáng)度增加，3)供體的熒光壽命縮短(Jares-Erijman and Jovin 2006)。這些來自于供體和受體不同的信息是獲取和分析FRET數(shù)據(jù)的一些策略的基礎(chǔ)。許多FRET方法依賴于基于強(qiáng)度的測量，例如供體猝滅、受體光漂白和敏化發(fā)射(Berney and Danuser 2003, Padilla-Parra and Tramier 2012, Algar WR et al. 2019)。基于強(qiáng)度的FRET簡化了儀器要求，但增加了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)產(chǎn)生假象的風(fēng)險(例如，供體-受體相對信號不平衡、通道間串色、供體光漂白、光致變性)或不太適合活細(xì)胞長時間觀察 (比如強(qiáng)光對樣品帶來的光毒性)。
為什么要使用TauInteraction？
FLIM（熒光壽命成像）-FRET方法仍然是FRET實(shí)驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)镕RET讀數(shù)只取決于供體熒光壽命的變化，從而繞過了基于強(qiáng)度的方法面臨的大多數(shù)風(fēng)險(Padilla-Parra and Tramier 2012, Algar WR et al. 2019)。然而，F(xiàn)LIM實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性使得這種基于FLIM的FRET分析方法長期局限在擅長生物物理的一些科學(xué)家群體中被使用。
在基于熒光壽命的方法中，人們一直在努力尋找不需要復(fù)雜的物理模型，更直接的方法來探索FRET效率。這些無需擬合的方法主要側(cè)重于提供相關(guān)數(shù)據(jù)，以便更好地理解正在研究的生物系統(tǒng)(Leray et al. 2013)。遵循這一理念的供體分子的最小比例(mf_D，minimal fraction of donor molecules)是一個簡單但很有用的概念(Padilla-Parra S et al. 2008, 2011 and Leray et al. 2013)。mf_D的目的是評估參與FRET的最小分子數(shù)量。mf_D與相互作用供體的比例有關(guān)(f_D，Padilla-Parra S et al. 2008)。為此，mf_D使用在沒有受體的情況下來自供體分子的熒光壽命值參與計(jì)算(圖1A)。根據(jù)這一點(diǎn)，它根據(jù)測量到的熒光壽命變化計(jì)算出必須與該供體相互作用的最小分子數(shù)量。通過這種方法，mf_D特別適合于基于相互作用蛋白質(zhì)的最小相對濃度實(shí)時地讀出分子間相互作用發(fā)生的程度。
 
圖一：TauInteraction原理圖. A) mf_D公式。詳情請見Padilla-Parra S et al. Biophys J. 2008. B) 圖示供體 (D, 綠色圓形) 和受體 (A, 紅色三角)。TauInteraction可以基于mf_D值描述相互作用的分子的百分比。
該如何使用TauSense來量化FRET
mf_D 概念非常適合于STELLARIS平臺，因?yàn)镾TELLARIS的TauSense工具可以直接獲取基于熒光壽命的信息（圖一及其參考文獻(xiàn)）。為了利用熒光壽命來定量讀出FRET狀態(tài)，我們實(shí)現(xiàn)了mf_D作為一個新的TauSense工具，稱為TauInteraction。TauInteraction的工作原理如下(圖一)：在FRET實(shí)驗(yàn)中，可能有許多分子(供體和受體)非常接近，如果這些是隨機(jī)事件，發(fā)生FRET的平均分子數(shù)量可以忽略不計(jì)。相反，如果分子之間存在活躍的相互作用，它們保持緊密接近的時候?qū)⒁鸸w熒光壽命的降低。如果發(fā)生這種情況，TauInteraction會報告導(dǎo)致這種變化的分子比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一張TauInteraction圖，其中包含在逐個像素級別上相互作用的分子的比例，圖片將實(shí)時(即在圖像采集期間)展現(xiàn)。此外，還提供了供體的熒光強(qiáng)度，如果需要，可以使用基于強(qiáng)度的FRET工具進(jìn)行獨(dú)立分析。
作為TauInteraction如何將分子相互作用轉(zhuǎn)化為定量讀數(shù)的一個例子，我們首先用串聯(lián)結(jié)構(gòu)來評估其表現(xiàn)，表達(dá)帶有短氨基酸序列的蛋白質(zhì)的供體-受體熒光蛋白對(EGFP-mCherry)( Tramier M et al. 2006)。這種結(jié)構(gòu)在瞬時轉(zhuǎn)染的活細(xì)胞中顯示出恒定的正FRET行為(見圖二)。有27%到29%的分子發(fā)生了互作。這與生物樣本中最大可觀察到的FRET是一致的(Padilla-Parra S et al.  2009)。如果我們有分離的供體和受體分子，相互作用的比例將低于這個最大值。如果我們降低受體分子的數(shù)量，我們就可以模擬這種情況。這很容易通過光漂白一些mCherry信號來實(shí)現(xiàn)。在光漂白一些受體并消除相互作用后，我們觀察到樣品中相互作用的分子的總比例下降了約50%(圖二)。
在STELLARIS上集成了基于熒光壽命的工具TauSense，比如TauInteraction，為研究人員以穩(wěn)定和可量化的方式研究FRET過程鋪平了道路，最終目標(biāo)是獲得生物相互作用的功能性數(shù)據(jù)。
 
圖二：活細(xì)胞中的TauInteraction。A)來自EGFP-mCherry串聯(lián)的強(qiáng)度圖像。B)在細(xì)胞上設(shè)置了三個感興趣區(qū)(ROI)，并在ROI1中使用高光強(qiáng)來漂白受體分子。圖中顯示了EGFP和mCherry的強(qiáng)度。TauInteraction圖像顯示了細(xì)胞中存在的相互作用分子的比例(以%值表示)，漂白區(qū)域的百分比明顯較低，這與受體分子的損失一致。
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利用簡化FRET-FLIM方法直觀研究蛋白質(zhì)相互作用
直播時間：北京時間2022年7月19日，22點(diǎn)
講者信息：
 
Dr. Sergi Padilla-Parra, Senior Lecturer, Randall Centre for Cell & Molecular Biophysics, King's College London
 
Dr. Julia Roberti, Product Manager, Leica Microsystems

 
 

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