DMi8與轉化醫(yī)學研究
——如何為您的研究選擇和配置顯微鏡
 
新冠也許是人類已知的作為危險的病毒之一，其傳播力強、途徑隱秘危害性大，而面臨如此大敵，多虧了核酸檢測技術發(fā)展才可以使其無所遁形。但是核酸檢測技術首先都需要對核酸中的信號進行放大，以新版的國家新冠指南中所描述，需要將收集到的DNA進行35個循環(huán)的擴展后才可以用于檢測，這個參數(shù)雖然較之之前的40個循環(huán)有所減少，但是放大倍數(shù)也有2³⁵之多，可以想象如果中間有任何錯誤都會被放大如此高的倍數(shù)。怎么樣才能測得準確呢？標準品是關鍵的保證之一。
面對新冠的核酸檢測方案中的標準品，上海交通大學的樊春海院士在此方面做出了最關鍵的貢獻。2020年初在他主持下的國家轉化醫(yī)學科學中心積極支持下，上海市計量院與交大的聯(lián)合團隊夜以繼日攻關，僅用42天及時研發(fā)出新冠核酸標準物質——GBW（E）091111和GBW（E）091112，并經國家緊急授權于2020年3月19日獲批，為核酸試劑盒提供計量溯源和質量控制依據(jù)，供百余家研制單位使用，為疫情防控做出重要貢獻和基礎保障。擁有170年光學技術沉淀的徠卡顯微系統(tǒng)也非常有幸能為樊院士的研究提供力所能及的支持。
 
圖片轉載自“上海科技”公眾號，作者：一諾
工欲善其事必先利其器，在成就偉大的科研成果之前，對設備的配置選擇是首要因素之一。光學顯微鏡通常是生命科學研究實驗室的主要設備之一。它可在多種應用中幫助解開科學謎團。因此，從明場顯微鏡到熒光顯微鏡和活細胞成像，顯微鏡的配置和功能對于其應用范圍至關重要。
 
 
 
您研究什么樣本？
選擇研究顯微鏡時，首要的考慮因素是研究的樣本類型。如果是放置在薄載玻片上的固定樣本，您可以選用正置顯微鏡?；罴毎麢z測則需要使用顯微鏡的特殊功能，因為它們是放在充滿細胞培養(yǎng)液的大細胞培養(yǎng)容器中。
 
 
圖1：左：放置固定樣本的載玻片，例如組織切片。右圖：用于細胞培養(yǎng)的有蓋培養(yǎng)皿。
只有物鏡在樣本下方而聚光鏡在樣本上方的倒置配置，才能提供基本的自由空間和物鏡與樣本之間的接近度。與此同時，倒置顯微鏡還可以很好地接近細胞，例如添加顯微操縱器。
此外，活細胞需要適當?shù)沫h(huán)境才能生存。溫度和二氧化碳濃度必須保持在一定水平。完成這項任務需要一個帶有相應控制器的氣候室。
 

 
圖2：左：正置顯微鏡的特點是物鏡在樣本上方，聚光鏡在樣本下方。右：倒置顯微鏡的設置恰好相反，主要是為了向用戶提供更多空間以及物鏡與樣本之間所需的接近度。
 
您認為是在哪些維度？
顯微樣本展開成三個維度：長度、寬度和高度。一些樣本，例如組織切片，僅在xy方向上成像，而其他應用可能也需要在z方向上進行采集。成像3D體積，例如，對于活細胞，建議使用電動物鏡轉盤，它能夠逐步引導您的樣本通過焦點。成像軟件應該能夠重建單個圖像以進行3D可視化。
對于活細胞，您必須添加時間維度。在這種情況下，系統(tǒng)穩(wěn)定性便是另一個關鍵特性。由于在采集過程中溫度變化會影響成像系統(tǒng)，因此必須采取有效的應對措施。自適應對焦控制（AFC）等自動對焦調整可消除這些熱影響，并始終找到預定義的焦點。
 

圖3：自適應對焦控制（AFC）也可以在長時間延時采集期間自動穩(wěn)定顯微鏡焦點。傳感器檢測到LED光束（850 nm）的運動，如果載有樣本的蓋玻片改變其位置，例如由于熱活動，就會發(fā)生這種運動。
 
哪種對比方法適合您的樣本？
用顯微鏡研究的大多數(shù)細胞——尤其是動物細胞——沒有足夠的內在對比度來讓研究人員觀察細節(jié)。研究人員使用對比方法來解決這個問題。相襯（PH）和微分干涉對比（DIC）可操縱穿過樣本的光以增加對比度，您也可以分別使用熒光蛋白通過熒光染料（免疫熒光）對其進行染色。
根據(jù)對比方法，顯微鏡需要特定的設備；例如相襯需要特殊的物鏡，而DIC使用某些必須切換到光路中的棱鏡。對于熒光顯微鏡，您需要特殊的熒光濾色塊，以促使正確的光波長進入和退出樣本。
 
 
圖4：用不同對比方法獲得的一系列神經元細胞。從左到右：明場、DIC、相襯、熒光
 
光源呢？
對比方法的選擇也決定了光源。用于傳統(tǒng)明場顯微鏡、相襯和DIC的透射光照明可以使用鹵素或LED照明進行。熒光顯微鏡可以通過LED照明或在汞燈、氙燈或汞金屬鹵化物燈的幫助下進行。
 
您想記錄或發(fā)布您的結果嗎？
如果您想拍攝樣本圖像或進行活細胞成像，則需要一個數(shù)碼顯微鏡攝像頭。特別是在熒光活細胞成像的情況下，建議使用靈敏的攝像頭，以盡量減少可能傷害細胞的激發(fā)光量。除了成熟的CCD和EMDDC攝像頭外，如今的sCMOS攝像頭也因其高量子效率和采集速度而得到應用。有關數(shù)碼顯微鏡攝像頭的更多信息，請閱讀文章“數(shù)碼攝像頭技術簡介”。
此外，大視野（FOV）有助于更快地找到感興趣的區(qū)域并同時成像更多細胞?，F(xiàn)代研究顯微鏡的攝像頭端口具有19毫米FOV，與19毫米sCMOS攝像頭芯片匹配。
通常，僅拍攝樣本圖像是不夠的，還需要分析您獲得的數(shù)據(jù)。為此，易于使用的成像和分析軟件有助于獲取定量數(shù)據(jù)并進行可靠的數(shù)據(jù)分析。
 
您是否需要采集厚樣本的（3D）信息？
厚樣本對顯微鏡檢查來說是一個挑戰(zhàn)。尤其是寬場顯微鏡在同時照亮整個樣本的情況下，來自焦點外區(qū)域的額外光會顯著減少焦點內的樣本特征。
成像解析可以幫助獲得沒有失焦光的圖像。該技術可以應用于單個圖像平面以獲得即時結果（ICC：即時成像解析），或者可以與額外的反卷積步驟（SVCC：小容量成像解析；LVCC：大容量成像解析）以獲得更好的結果。反卷積將光子信息重新分配給它們的起源，從而在焦平面中提供更好的所需結構對比度。與傳統(tǒng)的寬場圖像相比，這可以讓用戶更容易地將感興趣的結構與背景區(qū)分開來。
 

圖5：癌組織中的單分子RNA-FISH。RNA-01（綠色）、RNA-02（品紅色）左：原始數(shù)據(jù)。中：使用即時成像解析。右圖：大容量成像解析之后。由蘇黎世大學（瑞士）的Andreas Moor教授提供。
 
您想在顯微鏡上操作細胞嗎？
在過去的幾年里，樣本的圖像處理變得日益普遍。這意味著研究人員不僅要觀察活細胞，還要借助光來操縱它們。光漂白后的熒光恢復（FRAP）是有助于了解動態(tài)細胞過程的一個示例。對于這些類型的操作技術，通常需要額外的光源，這些光源必須集成到顯微鏡的光路中。
這種方法并非易事。徠卡無限端口是一種通用解決方案，可將附加光源耦合到顯微鏡的光路中，而不會影響圖像質量，例如：FRAP、光開關、消融或光遺傳學。有了合適的適配器，研究人員甚至可以連接他們的自制設備。
 
 
圖6：徠卡WFFRAP模塊（左側黑框）可通過無限端口與倒置研究顯微鏡徠卡DMi8連接。
 
您的預算是多少？
一個重要的問題是您可以投入的資金。一些顯微鏡供應商提供適合特殊應用的預定義配置。但是，如果您不需要所有付費的預配置組件怎么辦？這就是為什么免費配置組件比購買預定義的顯微鏡系統(tǒng)更經濟的原因。
此外，對顯微鏡的要求可能會隨著時間而改變。在這種情況下，可升級系統(tǒng)具有一定的優(yōu)勢。通過預定義和固定的配置，您會發(fā)現(xiàn)僅需有限數(shù)量的應用程序。可升級性讓您可以根據(jù)不斷變化的需求靈活配置。
考慮到這些因素，徠卡DMi8等模塊化顯微鏡平臺可以使研究人員從經濟的顯微鏡系統(tǒng)入門，然后隨著需求的增長而不斷升級。
 
 
圖7：利用模塊化設計，徠卡DMi8可以根據(jù)研究人員的需要進行配置。此外，如果需求發(fā)生變化，后期還可以進行升級。
 
誰使用顯微鏡？
顯微鏡用戶的范圍可能差異很大。尤其是在大學，用戶可能非常有經驗，也可能是絕對的初學者。因此，由徠卡應用套件X(LAS X)等直觀軟件運行的易于使用的顯微鏡系統(tǒng)有助于人們快速入門并快速獲取數(shù)據(jù)。例如，面向工作流的設計、圖像分析向導以及將外圍設備無縫集成到系統(tǒng)中可以簡化您的工作。
除了寬場研究顯微鏡外，體視顯微鏡也經常用于生命科學研究實驗室。您可以在“選擇體視顯微鏡時要考慮的因素”一文中了解更多信息。
 

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