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空間代謝組學(xué)方法表征腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性

更新時間:2024-05-22      點擊次數(shù):484

腫瘤的發(fā)展與腫瘤微環(huán)境息息相關(guān)。在癌癥發(fā)生中,正常組織中和諧的細(xì)胞相互作用關(guān)系被破壞,逐漸演變成適應(yīng)腫瘤生長的條件。腫瘤微環(huán)境的變化,可能導(dǎo)致不同細(xì)胞區(qū)室的基因、蛋白表達(dá)及信號通路的改變。針對腫瘤微環(huán)境的檢測和表征研究可為癌癥治療提供新的思路。


傳統(tǒng)分析技術(shù)受取樣精確度以及分析靈敏度的限制,無法精準(zhǔn)獲取靶向部位,而對其中特異代謝物的差異表征就更加困難。激光顯微切割技術(shù)可以方便地對特定的組織區(qū)域精確分離。結(jié)合高靈敏度的液質(zhì)聯(lián)用檢測技術(shù),從而將空間定位準(zhǔn)確的微區(qū)細(xì)胞代謝譜進(jìn)行全面準(zhǔn)確的表征。



實驗設(shè)計


樣品制備:

將腫瘤組織做冰凍切片,樣本置于徠卡LMD7激光顯微切割載物臺;接收端放置PCR管用于分離體的接收。選擇合適切割面積 ( ~1,000,000µm2用于代謝物建庫;~20,000µm2用于大樣本靶向分析)開始進(jìn)行切割(圖1)。切割完成后,小心收集樣品。共收集到來自10個病人的原位癌 (25份)、浸潤癌 (18份)、癌旁組織 (13份) 樣本共46份,每一份在平行的兩張張切片上同樣位置分別收集作為代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)分析。

空間代謝組學(xué)方法表征腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性

圖1. 組織切片樣本用于激光顯微切割分離體制備。經(jīng)過蘇木精-伊紅(HE)染色確定組織切片中不同類型的細(xì)胞區(qū)域(左)包括原位癌、浸潤癌和癌旁細(xì)胞,在平行的未染色組織切片中的相應(yīng)位置進(jìn)行激光顯微切割獲得分離體(右)。


樣品提取:

裝有樣品的PCR管加入50µL提取溶液(代謝組學(xué)樣本:甲醇:乙腈:水 2:2:1, v/v;脂質(zhì)組學(xué)樣本:二氯甲烷:甲醇 1:1, v/v),振蕩混勻,超聲15 min,離心后將全部溶液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中待LC-MS/MS分析。



LC-MS條件:

樣品通過ExionLC系統(tǒng)分別串聯(lián)SCIEX ZenoTOF 7600和SCIEX Triple Quad 7500 系統(tǒng)進(jìn)行代謝物建庫和大樣本量靶向代謝組學(xué)/脂質(zhì)組學(xué)分析。



實驗結(jié)果:

數(shù)據(jù)通過SCIEX OS 軟件3.1中的定性、定量功能處理。在代謝組學(xué)樣本中共檢出100個代謝物,脂質(zhì)組學(xué)樣本中共檢出502個代謝物,并將這些化合物在所有的樣本進(jìn)行峰面積提取。將獲得的各種組織中化合物含量信息進(jìn)行生物統(tǒng)計學(xué)分析,以浸潤癌組織v.s.癌旁組織為例,尋找表征區(qū)分這兩種組織的差異代謝物。以t-檢驗p-value值小于0.05以及PLSDA分析VIP值不小于1作為篩選條件,對這兩種組織的區(qū)分,共找到84個差異代謝物(圖2)。

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圖2. 浸潤癌組織v.s.癌旁組織中的差異代謝物熱圖。通過統(tǒng)計學(xué)分析,包括t-test的p值小于0.05以及PLSDA計算的VIP值不小于1作為篩選條件,獲得了84個差異代謝物。


結(jié)

通過對組織切片進(jìn)行激光顯微切割獲取空間定位準(zhǔn)確的微量樣本,并與SCIEX ZenoTOF 7600和SCIEX Triple Quad7500系統(tǒng)相結(jié)合,實現(xiàn)微量細(xì)胞水溶性和脂溶性代謝物的全面表征以及高靈敏度組學(xué)分析。


可將此方案應(yīng)用于其他組織切片樣本,助力空間組學(xué)研究的開展。

感謝SCIEX中國的支持


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