熒光既可以是生物和無機結構的自發(fā)熒光，也可以是用特殊染料（熒光染料、熒光標記）處理標本后產生的所謂二次熒光 ^[1-3]。要在顯微鏡中進行熒光成像，必須滿足以下要求：強光源（LED 或氣弧燈）、用于準確選擇激發(fā)和發(fā)射光的適當透射濾光系統(tǒng)，以及適合的熒光成像的光學部件，即聚光鏡、照明部件、分光鏡、物鏡、鏡筒透鏡、目鏡和照相機 ^[4]。使用共聚焦顯微鏡系統(tǒng)可以進行多光子熒光顯微鏡觀察，使用比發(fā)射光波長更長的 2 個或更多光子進行激發(fā)^[5]。

與今天相比，熒光顯微鏡的shouci應用是在透射光和暗視野顯微鏡的基礎上進行的，這是因為當時熒光顯微鏡的應用范圍有限。但是，隨著熒光顯微鏡在組織學、細胞學、分子生物學和免疫診斷等領域的應用日益重要，人們越來越需要從根本上改進照明和觀察技術。這一需求催生了落射光顯微鏡或入射光熒光顯微鏡的誕生 ^[6]。

經(jīng)過近 40 年的發(fā)展和改進，這項技術已成為生物學、醫(yī)學、材料科學和工業(yè)領域常規(guī)和研究工作的基本工具之一。入射光熒光顯微技術的進步主要得益于 Ploem 小組的研究工作及其yinlin潮流的作用，同時也得益于 Leitz（現(xiàn)為 Leica Microsystems）在開發(fā)所需光學儀器方面的前瞻性戰(zhàn)略。

本文將介紹這一發(fā)展歷程。

圖 1：a) 熒光多波長落射光源，四個二向色鏡安裝在滑塊中，用于紫外、紫光、藍光和綠光激發(fā)光的入射照明。b) Leitz 多波長落射光源原型（未商業(yè)化），帶有四個安裝在滑塊中的二向色鏡^[20]。

很快，人們發(fā)現(xiàn)使用窄波段藍光和綠光激發(fā)為檢測廣泛使用的免疫熒光標記--異硫氰酸熒光素（FITC）和異硫氰酸四甲基羅丹明（TRITC）提供了最佳可能性。使用藍光和綠光激發(fā)還能最大限度地減少組織成分的自發(fā)熒光，這是傳統(tǒng)的紫外線透射照明達不到的效果?，F(xiàn)在，F(xiàn)ITC 可以使用窄帶藍光（使用半寬為 16 納米的帶干擾濾光片）激發(fā)，接近 490 納米（長藍波長）的激發(fā)最大值，并能清楚地觀察到 520 納米的綠色熒光發(fā)射峰。組織成分的自發(fā)熒光被降至zui低（圖 2a 和 b），從而獲得高對比度。

圖 2：a) 用 FITC 對組織細胞進行免疫標記，并用寬波段紫外線激發(fā)光照射。b) 與 2a 相同的組織和免疫印跡，使用窄波段藍光（490 納米）進行落射照明。注意圖像對比度的增加 ^[19]。

將 FITC 激發(fā)至其激發(fā)最大值附近可實現(xiàn)高效激發(fā)，甚至可以使用在藍色波長范圍內沒有強發(fā)射峰的汞燈。此外，使用綠色反射二色鏡進行落射照明，還shouci實現(xiàn)了用 546 納米的強汞發(fā)射線激發(fā) Feulgen-pararosaniline （圖 3a 和 b）。

圖 3：a) 肝組織。用 Feulgen-parosanilin 對 DNA 進行染色，并用透射綠光觀察細胞核。這種染色劑被稱為吸收性染色劑，不具有熒光性。用窄帶綠光（546 納米）照射其中一個細胞核，產生紅色熒光。使用窄波段綠光（546 納米）和反射綠光的二向色鏡進行落射。這可能是第一個用綠光激發(fā)顯微鏡的例子^[19]。注意圖像對比度大。

圖 4：用于熒光顯微鏡的完整徠茲濾光塊，包含激發(fā)濾光片、二向色鏡和發(fā)射（屏障）濾光片。

由于這種照明部件可將濾光塊快速轉入光路，因此對同一組織切片進行多波長照明成為現(xiàn)實。此外，用戶還可以更換照明部件中的四個濾光塊（圖 1c）。用戶可以從許多濾光塊中選擇不同的四組濾光塊進行組裝，這些濾光塊包含激發(fā)片、發(fā)射片和二向色鏡的組合，是為不同應用而開發(fā)的。根據(jù) Ploem 的建議，Leitz 還生產了一種帶落射照明的倒置顯微鏡（圖 5a 和 b）。有關用于多波長熒光顯微鏡的 PLOEMOPAK 照明部件的綜述，請參閱 Pluta ^[23] 的綜述。

圖 5：a) 帶有多波長落射照明部件的徠卡倒置熒光顯微鏡。b) 在移植研究中，用裝有落射照明部件的倒置顯微鏡對在Terasaki^®塑料皿中的人類淋巴細胞的熒光細胞毒性檢測試驗進行成像。c) 8濾光塊的Leitz電動落射照明部件。

圖 6：a) 大鼠腸系膜，小血管周圍有藍色熒光腎上腺素能（CA）神經(jīng)叢和黃色熒光肥大細胞（5-HT）。b) 與 6a 相同的組織和染色，采用落射照明和窄帶紫光激發(fā)光（LP 3 mm、Y 400 和 SP 425 干涉濾光片），495 nm 的二向色鏡反射紫光，以及 LP 460 nm 的屏障濾光片。這個濾光塊shou次觀察到了藍色熒光腎上腺素能神經(jīng)纖維，與黃色熒光肥大細胞截然不同^[25]。

圖 7：用抗 kappa TRITC 結合物和抗 IgG FITC 結合物對骨髓細胞進行染色。用窄波段綠光和藍光外顯，含有 TRITC 的細胞發(fā)出紅色熒光，含有 FITC 的細胞發(fā)出綠色熒光。有些細胞同時含有 FITC 和 TRITC。

圖 8： "蓮座狀 "的人類血細胞。用紫外光落射照射用藍色熒光染料石炭酸染色的紅細胞。曙紅染色的淋巴細胞經(jīng)綠光激發(fā)后用發(fā)射出橘紅色的熒光^[19]。

在落射照明中，使用二向色鏡將入射光偏轉到樣本上。二向色鏡的光譜特性是這樣設計的：只有所需的激發(fā)波長才能通過物鏡向下偏轉到樣本上，而不需要的波長則會被二向色鏡透射并收集到二向色鏡后面的光阱中^[21]。消除這些不需要的激發(fā)光可顯著減少雜散光，從而提高圖像對比度。二色鏡可將所需的（短波長）激發(fā)光通過物鏡偏轉到樣本上，但對較長的熒光波長是透明的。抑制濾光片（屏障濾光片）可吸收（或反射）從標本和物鏡透鏡表面反射的激發(fā)光，但對熒光高度透明，熒光隨后可到達目鏡或相機傳感器。落射照明的效率與物鏡數(shù)值孔徑（NA）的四次方有關，物鏡首先用作聚光器，然后作為聚光鏡用于觀察。在第一臺多波長落射照明設備上市時，只有高 NA（0.95、1.30）的高倍率物鏡（70x、100x）可供選擇。根據(jù) Ploem ^[19,20]的建議，Leitz 成為diyi家生產中等功率物鏡的制造商，如 NA 為 1.30 的油浸 40x 物鏡（圖 9）。這種新型物鏡專為落射照明熒光顯微鏡而設計，可產生非常明亮的圖像，從而縮短了常規(guī)熒光顯微攝影的曝光時間。

圖 9：早期的 Leitz 40x 油浸物鏡原型（"Versuchs"），NA 值為 1.30，用于熒光落射照明技術的試驗^[20]。

在過去的十年中，分子生物學的應用急劇增加，因此開發(fā)出了許多適用于各種應用的濾光片組合，其被安裝在各種濾光塊支架中。熒光落射照明可通過手動或電動方式切換2至8個濾光塊。在此不對各種濾光快的多種應用進行全面詳細的討論。

圖 10：使用反射-對比顯微鏡（RCM）觀察和拍攝的附著在載玻片上的被單克隆抗體標記的小鼠腹腔巨噬細胞。單克隆抗體對該樣本的表面抗原進行了標記，然后使用了免疫過氧化物酶染色。由于DABox染料的強反射，可以看到在普通顯微鏡下無法觀察到的細胞突起的細長部分。

圖 11：用過氧化物酶 DAB 染色法制備的腎組織超薄切片（約 35 納米厚）。與熒光顯微鏡相比，用反射對比顯微鏡觀察腎小球的線性染色模式能獲得更清晰的圖像。

電子顯微鏡（EM）中使用的大多數(shù)免疫染色物質的強反射提供了如此高對比度，以至于這種染色可以與許多經(jīng)典的（吸收性的）組織化學染色物質結合在一起，用于顯示適度強反射的重要大分子。后者的染色通常用于增強細微的形態(tài)定位，并且在許多情況下，比僅使用熒光標記物更精確地確定了免疫標記物的位置。此外，這樣的光學顯微鏡觀察結果可以通過使用具有相同免疫染色的下一個超薄切片進行電子顯微鏡檢查來進行確認。

圖 12：用于反射對比顯微鏡的濾光塊包含一個偏振鏡、一個中性（50%）分光鏡和一個分析器。該濾光塊可插入 Leica 熒光顯微鏡中落射照明部件的一個位置。

通過共聚焦激光掃描顯微技術，可以在不需要特殊物鏡或其他減少雜散光光學措施的情況下執(zhí)行反射式對比顯微（RCM），得益于通過小孔照明消除雜散光的效果。大多數(shù)具有吸收特性的免疫染色劑對激光有著非常強的反射作用，并且其褪色現(xiàn)象極為有限。這些染色劑常允許采用更小的小孔尺寸（例如，10微米），此尺寸比在共聚焦熒光激光掃描顯微中使用的大多數(shù)熒光染料所能接受的小孔尺寸?。槠湮宸种坏绞种唬?。因此，反射型免疫標記的使用可顯著提高光學分辨率。使用熒光染料雙重染色并通過Leica共聚焦激光掃描顯微鏡成像的樣本，提供了同時檢測多個標記物和一個反射型免疫標記物的可能性。

RCM 使用熒光顯微鏡架、落射照明部件和高強度光源（如氣體弧光燈）。在熒光落射照明部件中，必須插入一個額外的偏振濾光塊，其包含偏振片、反射器和分析器（圖 12）。此外，還必須將反射對比（RC）光闌模塊（包含中央光闌系統(tǒng)）置于入射光路徑中。該RC光闌模塊適配具有中央光闌和/或孔徑光闌的滑動組。此外，應該將專門為反射對比顯微鏡開發(fā)的特殊目鏡添加到顯微鏡目鏡套裝中。

反射光顯微鏡的對比度基于反射強度（反射率）的差異。對于這種顯微鏡，光的反射發(fā)生在每一個光學邊界，即當折射率和/或吸收率發(fā)生變化時。對于反射率小于 1%（大部分小于 0.2%）的生物標本，由于顯微鏡管內存在不必要的反射，因此使用傳統(tǒng)顯微鏡幾乎不可能獲得反射光圖像。 第一種方法是在入射光路徑上與物鏡后焦平面（孔徑）相接的平面上插入中心擋片（帶有中心擋片的光圈光闌，形成環(huán)形孔徑），使入射光成為環(huán)形光錐。第二種方法是使用“防反射"方法減少不必要的散射光或反射光。通過使用交叉偏振片來抑制顯微鏡內部的反射光，從而使只有從標本反射的光才能傳遞到目鏡或相機傳感器。因此，物鏡的前透鏡上裝有四分之一波板。光線通過四分之一波板時（向下到達樣本，從樣本反射后向上），光線的偏振方向會改變?yōu)?2 x 45° = 90°。

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