在成像過程中避免熒光串擾的誤導效應

多通道一詞是指使用多種熒光染料來檢查一個樣本中的不同元素。多通道成像可以同時觀察相關(guān)組分和過程，從而為您的觀察添加更多背景信息，最終提供更有意義的結(jié)果。 這種多色實驗的一個例子是活細胞/死細胞實驗，該試驗已使用兩種顏色，但可與額外的標志物相結(jié)合，產(chǎn)生 更高的信息密度。 它還有助于觀察采用其他方法可能會遺漏的相互依賴性。
圖像： 成年大鼠腦。神經(jīng)元（Alexa Fluor488，綠色）、星形膠質(zhì)細胞（GFAP，紅色）、細胞核（DAPI，藍色）。圖像由中國廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)科學研究所和神經(jīng)內(nèi)科徐恩教授提供。

簡介

多色或多通道顯微成像在研究中常用于更好地描述疾病特征，以及更好地了解生物過程。例如在免疫腫瘤學中，有必要研究不同免疫細胞相對于關(guān)鍵生物標記物的位置。在神經(jīng)科學中，了解神經(jīng)元突觸的復雜性通常需要研究多種蛋白質(zhì)。在研究連通性時，必須清楚識別不同類型的神經(jīng)元及其位置。
多通道成像需要使用多個熒光團來對感興趣的不同標記物染色。為實驗選擇合適的熒光團組合至關(guān)重要。每個熒光團都有一個特征發(fā)射光譜，即其發(fā)射光的波長范圍。大多數(shù)熒光團的發(fā)射光譜很寬，因此當使用兩個或多個熒光團時，它們可能會重疊，導致信號串擾。如果在實驗中不考慮串擾，數(shù)據(jù)可能會導致假陰或假陽的結(jié)果，或其他形式的模糊數(shù)據(jù)。因此，區(qū)分熒光團對于在多通道成像時獲得最佳結(jié)果至關(guān)重要。本文詳細討論了在設置多色熒光實驗以及避免重大缺陷方面需要考慮的一些事項。

選擇合適的熒光團組合

選擇合適的熒光團來標記樣本時需要仔細考慮，如果要避免串擾，應確保熒光團與活細胞相容，并消除生理學方面的副作用。
閱讀本文，進一步了解熒光團與活細胞的相容性和生理學副作用
盡管市場上提供的熒光染料數(shù)量顯著增加，但信號分離問題仍然存在。因此，對標記策略的選擇仍然非常復雜，而且隨著添加的熒光團越來越多，實驗的設置也變得更加復雜。
為了避免串擾，光譜分離需要考慮以下因素：

• 熒光團激發(fā)和發(fā)射光譜必須與系統(tǒng)的光源和濾光片組特性相匹配，并且

• 每個熒光團的發(fā)射光譜在探測窗口之間的重疊必須盡可能少。
  如何捕捉多個熒光信號？

• 例如，考慮一種常見寬視場（常被含糊地稱為“熒光顯微成像"）多色實驗的情況。通常會使用寬視場熒光顯微鏡，因為操作簡便且圖像采集快。寬視場多色實驗中的每個標記都使用專用的激發(fā)和發(fā)射濾光片組進行識別，這可以確保在從每個熒光團獲得單個信號時具有高度的特異性。激發(fā)和發(fā)射濾光片通常放置在顯微鏡內(nèi)單獨的濾光片輪中。這種設置已經(jīng)限制了可以為實驗選擇的熒光團。樣本中的熒光團可能與顯微鏡中已經(jīng)安裝的濾光片不相容。當然，濾光片組濾色塊可以更換為其他市售濾色塊，但這個過程通常很繁瑣。
  選擇與可用濾光片和光源相容的熒光團并將樣本染色后，下一步就是設置系統(tǒng)。首先必須選擇濾光片，然后進行平衡，以達到一定程度的信號探測和最小程度的串擾。接下來要對濾光片進行調(diào)整來限制波長帶通，并使發(fā)射光以各個熒光團的峰值波長為中心。這個步驟能夠減少探測到來自其他熒光團的無用發(fā)射光。
  濾光片通過以下方法“凈化"單個熒光團的信號：

• 最大限度減少激發(fā)無用的熒光團，也就是那些與所使用的特定濾光片不相容的熒光團；以及

• 消除與所需熒光團的峰值發(fā)射波長不匹配的信號干擾（光輸入）。

所選的探測窗口帶寬決定了將探測到多少無用的信號以及會丟棄多少有用的光信號——窄帶寬意味著特異性較高，但效率較低；而寬帶寬則意味著特異性較低，但效率較高。使用的熒光團數(shù)量越多，這個平衡過程就越復雜。理想情況下，每個熒光團組合都需要一組優(yōu)化的濾光片，以便從每個熒光團捕獲最大的發(fā)射強度，同時使探測通道之間的串擾最小化。即使使用此方法，一個熒光團的發(fā)射光仍然會滲入用于另一個熒光團的探測通道。因此，通過調(diào)整濾光片來減少串擾會犧牲有用信號，這可能導致關(guān)鍵數(shù)據(jù)丟失。所有這些因素都使獲得良好熒光圖像變得復雜。
另一個考慮因素是這種激發(fā)/發(fā)射機制的性質(zhì)，它意味著每個單獨的熒光團必須依次成像，即依次使用一個又一個濾光片，這意味著需要更多時間來更換濾光片和采集圖像。這個過程必須為每個位置、焦平面和時間點重復進行，這意味著每增加一個熒光團，采集完整的樣本圖像就需要更多的時間。在活體樣本的實驗中，從一個熒光團切換到另一個熒光團所需的時間會限制捕獲速度，導致錯過快速的過程以及降低各種顏色之間的可比性。
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在多通道實驗過程中避免串擾的其他方法

可以使用其他消除串擾的方法，例如在采集后進行線性光譜拆分。 這種方法的前提條件是光譜成像，即探測分別包含不同發(fā)射信息的多張圖像[1]。光譜成像可以在寬視場或共聚焦顯微鏡上以多種方式進行。在寬視場熒光顯微鏡中，此操作通常需要專用的濾光片，并且仍然需要連續(xù)采集，這非常耗時，而且由于重復激發(fā)，容易發(fā)生光漂白。
線性光譜拆分法可以確定每個熒光團對每個圖像像素的相對貢獻，方法是以計算方式拆分所測量信號的熒光元素，并將其與參考發(fā)射光譜輪廓匹配。使用線性光譜拆分法需要事先了解熒光團發(fā)射光譜，并且通常需要制定復雜的手動后期處理計劃。此外，對有噪圖像使用這種方法可能容易出錯。要避免處理后的圖像中出現(xiàn)偽影，必須通過背景消減法去除并非來自熒光團的任何信號。此外，由于線性光譜拆分是一種基于像素的方法，因此它容易受到原始圖像或參考光譜中所引入誤差的影響。因此，噪聲的存在使得光譜拆分后數(shù)據(jù)的任何潛在誤差與熒光團的光譜重疊成比例增加。這種效應會影響低光照強度下拍攝的圖像，例如在對活體樣本成像時。
是否有更好的方法？

成像領域的最新創(chuàng)新包括將相量分析應用于光譜數(shù)據(jù)[2]。Cutrale 等人[3]開發(fā)了一種有效的方法，即使在低噪聲機制中也能拆分多個熒光團，而無需了解發(fā)射特性和顯微鏡的透射特性。該方法既快速又可靠，而且基本上能夠分離自發(fā)熒光等背景信號和真正的單個信號。
基于相量的分析法最初被認為是一種將熒光壽命信息可視化的有效方法，最近 Cutrale 等人調(diào)整了這個方法，能夠在不使用參考光譜的情況下實時分離光譜信息。結(jié)果是，不僅分離了來自光譜圖像采集的熒光信號，而且可以去除無用的信號，如自發(fā)熒光，從而改善實驗的最終結(jié)果。此外，光譜成像數(shù)據(jù)分析的整個工作流程得到簡化，因此它不需要像其他方法（如線性光譜拆分）那樣進行廣泛的校準。
通過光譜相量分析可以快速可靠地拆分熒光顯微成像的光譜圖像

光譜成像中運用的相量分析是一種已公開發(fā)表的方法，可用于簡化多通道成像實驗并提高其準確性。

圖 1：MDCK細胞 DNA 用Hoechst（藍色）染色，線粒體用Alexa 488（綠色）染色，微管用Alexa 555（紅色）染色，樣本由馬爾堡大學 Ralf Jacob 教授提供。

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